Introduction
Materials and Methods
시료 제조
게놈 DNA 추출 및 polymerase chain reaction (PCR) 검정
JG21 잔디의 목적 단백질 발현 분석
잉어(C. carpio) 배양 조건
잉어에 대한 시료 처리조건
급성 독성 평가를 위한 조사 항목
Results and Discussion
JG21 잔디의 유전자 도입 유전자 검정
시료처리용 시험용수의 수질변화 검정
들잔디와 JG21 잔디의 처리 농도별 잉어 치사 개체 분석
들잔디와 JG21 잔디의 급이에 의한 잉어에 대한 급성독성
Conclusion
Introduction
들잔디(Zoysia japonica Steud.)의 원산지는 한국을 포함한 극동아시아 국가이며, 현재는 전 세계적으로 분포하고 있다. 들잔디는 가뭄 및 질병에 대한 저항성이 높고, 상대적으로 성장 속도가 느리기 때문에 축구장 또는 골프장 등의 스포츠 및 여가 환경에 널리 이용되고 있다(Bae et al., 2008). 또한 공원, 정원 등의 미적 가치 증진을 비롯하여 도로 비탈면, 댐, 간척지 등의 토양침식방지와 같은 다양한 목적으로 이용될 수 있다(Sun et al., 2010; Kim, 2012). 이에 따라 잔디와 관련한 사업규모가 매년 확대되고 있으며, 이는 잔디의 잡초방제 및 병해충 방제를 위한 농약 사용량의 증가 및 농약의 과다사용으로 인한 환경오염 문제의 원인이 되고 있다(Choi et al., 1990; Schleicher et al., 1995). 또한, 잔디의 급격한 수요 증가로 인해 병해충 저항성, 내한성, 제초제 저항성, 내음지성, 녹기 연장 등 다양한 형질을 가진 잔디품종의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 들잔디의 품종육성은 전통적인 육종방법을 이용하고 있으나 타 작물의 경우와 마찬가지로 고전육종기술의 한계점들이 발견됨에 따라 최근에는 분자생물학적 방법을 이용한 신품종 개발이 시도되고 있다(Inokuma et al., 1998; Rim et al., 2001; Kim et al., 2004; Zhang et al., 2007). 현재 가장 연구가 많이 진행된 GM (genetically modified) 잔디는 제초제 저항성 GM 잔디로, ammonium glufosinate에 대한 저항성을 나타내는 GM 잔디이다(An et al., 2009).
최근 보고에 따르면 GM 잔디를 비롯한 세계 GM 작물의 재배 면적이 2억 220만 헥타르를 기록했다(AgbioInvestor, 2023). 또한 2023년 국내에서 수입 승인된 식품용, 사료용 유전자변형생물체는 약 1,028만 톤, 총 수입금액은 약 34.2억 달러에 달하는 것으로 나타났다(KBCH, 2024). 이와 같은 GM 작물의 실용화를 위해서는 GM 작물에 도입된 유전자들의 농업 환경생물종 및 농업환경 생태계에 미치는 영향과 잡초화 가능성 등을 평가하는 환경위해성 평가, 그리고 영양 성분 분석, 알레르기 및 독성 평가 등의 필수적인 안전성 평가가 이루어져야 한다(Oh et al., 2014, 2020; Lee et al., 2015). 일반적으로 표준 생태독성학적 연구는 수생 환경 생물에 대한 영향 평가 및 환경에 대한 잠재적 위험성 평가를 포함한다(Yeom and Lee, 2006). 어류를 포함한 수생 환경 생물에 대한 환경 생물 독성시험을 평가하기 위해서는 시험 생물종의 선택이 매우 중요하며, 시험 생물종을 선택할 때에는 실험 방법론과 생태학적 문제뿐만 아니라 생물종의 공급 및 분석 비용 및 적합성을 고려되고 있다(Oh et al., 2014). 잉어(Cyprinus carpio Carp)는 국내수계에 자생하며 OECD 국가를 비롯하여 국내에서도 비교할 수 있는 기존의 독성 자료가 풍부한 생물종이며, 환경생물 독성 시험 기준과 방법(농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에 명시된 환경생태독성 시험 생물로서 가장 널리 사용되는 생물검정 재료이다(Oh et al., 2014). 따라서, 본 실험에서는 제초제 저항성 GM 잔디에 대한 환경위해성 평가를 분석하기 위하여 수생 환경 생물종 중 하나인 잉어(C. carpio)를 시험종으로 선정하였다.
본 연구에서는 GM 잔디가 잉어에 미치는 급성 독성 여부를 분석하기 위하여 모품종인 들잔디와 제초제 저항성유전자인 phosphinothricin acetyltransferase (PAT)가 형질전환된 제초제 저항성 GM 잔디를 이용하였다. 제초제 저항성 유전자의 도입 및 발현 여부를 확인하고, 모품종인 들잔디와 비교하여 GM 잔디가 잉어에 미치는 영향을 분석하였다. 이를 통해 제초제 저항성 GM 잔디의 환경생물종에 대한 영향성을 평가하고 GM 잔디의 생산자와 소비자에게 신뢰성 있는 안전성 데이터를 확보하여 국내 GM 잔디의 안전성 평가를 위한 기초 자료를 활용할 수 있을 것이다.
Materials and Methods
시료 제조
본 실험에 이용한 제초제 저항성 GM 잔디(이벤트명 Jeju Green 21, 이하 JG21)는 모품종인 들잔디에 ammonium glufosinate에 대한 저항성 유전자인 PAT가 Agrobacterium 형질전환법을 통해 도입된 잔디이다(Toyama et al., 2003).
2022년 8월 23일에 국립농업과학원 LMO (living modified organisms) 격리 포장(Jeonju, Korea, RDA-AB-2013-041)에서 재배중인 모품종인 들잔디와 JG21 잔디의 잎과 줄기를 채취하였다. 이후 실험실용 동결건조기(FD8518, ilShinBioBase, Korea)를 이용하여 시료를 완전히 건조한 후, Planetary Ball Mills (PM100, Retsch, Germany)를 이용하여 분말화하였다. 분말화된 시료는 600 µm 표준망체(Chung Gye Sang Gong Sa, Korea)를 이용하여 선별한 후, 사육용수에 현탁하여 잉어의 급성독성 분석용 시료로 사용하였다.
게놈 DNA 추출 및 polymerase chain reaction (PCR) 검정
들잔디와 JG21 잔디 시료를 액체질소에 얼린 후 막자사발을 이용하여 분말화하였다. 분말 시료 100 mg과 Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)를 사용하여 들잔디와 JG21 잔디의 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 잔디의 genomic DNA는 마이크로플레이트리더(BioTek, USA)를 사용하여 추출된 genomic DNA를 정량 분석 하였다. JG21 잔디에 도입된 T-DNA의 유전정보를 기반으로 PAT 유전자 검정용 프라이머를 제작하였다(Table 1). PCR 분석을 위하여 들잔디와 JG21 잔디의 genomic DNA, 프라이머 및 2X Hot Taq PCR Master Mix (CellSafe, Korea)를 첨가한 후 반응하였다. PCR 반응조건은 94℃ 5분 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 30회 반복하여 증폭한 후, 72℃에서 5분간 반응하였고, C100TM Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였다. 합성된 각 검정 유전자들의 PCR 산물은 1% 아가로스겔에서 전기영동한 후 분석하였다.
Table 1.
Primers list and sequence used for PCR (polymerase chain reaction) analysis.
JG21 잔디의 목적 단백질 발현 분석
JG21 잔디의 PAT 단백질 발현 검정을 위하여 immunostrip 검정을 실시하였다. 들잔디와 JG21 잔디를 샘플링한 후 증류수와 Biomasher II (LMS, Japan)를 이용하여 단백질을 용출하고, SeedChekTM LL (Romer Labs, Austria)에 대한 반응을 분석하여 immunostrip 검정을 수행하였다.
잉어(C. carpio) 배양 조건
급성독성분석용 생물종인 잉어(C. carpio)는 오창 양어장(Ochang, Korea)에서 구입한 후, 한국화학융합시험연구원(Hwasun, Korea)에서 배양하여 시험에 이용하였다. 잉어는 총 용량 20 L의 장방형 유리 수조에서 약 24도의 온도 및 16 h / 8 h (조도 300 - 600 lx)의 광조건으로 배양하였으며, 매일 일정시간마다 1 g의 탑밀(Jeilfeed, Korea)을 먹이로 공급하였다. 자동온도측정기를 이용해 잉어 사육실 및 수조 내 온도가 매 30분마다 측정되도록 설정하여 시험에 영향을 미칠만한 온도변화가 없음을 확인하였다. 잉어의 배양에 사용된 시험 용수는 수돗물을 전처리필터(1.0 µm)와 세균제거 필터(0.2 µm)로 여과시킨 후 저수조에서 48시간 이상 폭기시킨 후 이용하였다. 시험에 사용된 용수의 수질은 환경부에서 고시한 먹는물 수질공정시험기준(TAK-2018-184933, 2019-01-08, Annex 2)에 따라 한국화학융합시험연구원에서 분석을 실시하였다.
잉어에 대한 시료 처리조건
잔디 시료에 대한 예비시험 결과를 바탕으로 본 시험의 농도(0, 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 및 20,000 mg·L-1)를 설정하였다. 잔디 시료를 처리한 후 0, 24, 48, 72 및 96시간 마다 잉어 및 생육 환경에 대한 시험 항목들을 분석하였다. 무처리구는 시험용수인 수돗물을 사용하였으며, 양성대조구는 환경생물독성시험에 대조물질로 사용되는 3,5-Dichlorophenol (Sigma-Aldrich, USA)을 처리하였다. 잉어의 급성 독성 시험은 원통형 유리수조(용량 20 L, 38 cm H × 28 cm φ)에 시험용액 10 L씩을 제조하여 수행하였다. 각 처리군의 시험 대상 잉어 개체는 10마리로 설정하였고, 모든 시험은 3반복으로 수행하였다. 잔디 시료 처리 24시간 전부터 시험 종료 시까지 모든 처리구 내 잉어의 먹이 공급을 중단하였다. 또한 잔디 시료 처리 기간 동안 24시간 간격으로 산소 폭기를 실시하였다.
급성 독성 평가를 위한 조사 항목
들잔디와 JG21 잔디의 잉어에 대한 급성 독성을 평가하기 위하여 24시간 간격으로 총 96시간까지의 이상 증상 및 치사 여부를 판별하였으며, 잉어의 움직임이 없거나 아가미 호흡이 중단된 경우 치사한 것으로 판단하였다. 잔디 시료 외 잉어의 생육에 대한 외부조건의 간섭여부를 판단하기 위하여 매일 1회 잉어 사육 수조의 수온, pH와 DO (dissolved oxygen)를 측정하였다. 추가로 시험 종료 후 잉어의 평균 체중과 평균 전장을 측정하여 비교하였다. 각 처리구의 반수치사농도(lethal concentration 50, LC50)는 probit method 및 Trimmed Spearman-Krber method를 적용하였으며 CETIS (Version 1.9.3.0, Tidepool Scientific Software, USA) 프로그램을 이용하여 산출하였다. 본 연구의 급성 독성 시험은 농촌진흥청 고시 제2019-5호(2019-03-21) [별표 13]의 13-1-1. 담수어류급성독성시험 기준 및 한국화학융합시험연구원에서 제시한 표준작업지침서에 따라 수행하였다.
Results and Discussion
JG21 잔디의 유전자 도입 유전자 검정
잉어 급성 독성 평가에 사용된 JG21 잔디의 시료에 대한 제초제 저항성 유전자(PAT)의 도입을 검정하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. 모품종인 들잔디의 genomic DNA에서는 PAT 유전자가 검출되지 않았으며, JG21 잔디의 genomic DNA로부터 특정 밴드가 검출되었다. 이로부터 본 실험의 잉어 급성 독성 평가에 사용된 JG21 잔디에 PAT 유전자가 정상적으로 도입되었음을 확인하였다(Fig. 1).
이전에 수행된 연구에서 JG21 잔디 내 PAT 단백질의 발현량은 26.75 ± 2.24 µg·g으로 보고되었다(RDA, 2015). 이를 바탕으로 본 연구에 사용된 JG21 잔디에서 PAT 단백질의 발현이 정상적으로 유지되고 있음을 확인하기 위하여 PAT 항체를 이용한 immunostrip 분석을 실시하였다. 잉어 급성독성 실험에 사용된 JG21 잔디와 들잔디의 시료들을 immunostrip을 이용하여 반응한 결과, PAT 단백질은 JG21 잔디에서 발현함이 확인되었으며 모품종인 들잔디에서는 검출되지 않았다(Fig. 2).
시료처리용 시험용수의 수질변화 검정
들잔디와 JG21 잔디의 잉어 급성 독성 시험 처리 기간 동안 모든 처리구의 수조에 대하여 수온, pH 및 DO 등을 1일 1회씩 측정하여 시험 용액의 수질 상태를 확인하였다. 시험용수의 pH는 무처리군에서 7.6815 ± 0.006 (7.672 - 7.688) 수준이였다. 들잔디와 JG21 잔디를 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 및 20,000 mg·L-1 농도로 처리한 후 각 농도별 처리구의 pH를 측정한 결과, 들잔디 처리구의 pH는 각각 7.61 ± 0.01, 7.53 ± 0.01, 7.46 ± 0.01, 6.86 ± 0.00 및 6.80 ± 0.01로 측정되었으며, JG21 잔디에서는 각각 7.62 ± 0.01, 7.56 ± 0.00, 7.48 ± 0.01, 6.89 ± 0.01 및 6.83 ± 0.01로 측정되어 두 잔디 품종의 시료 처리 농도가 높아짐에 따라 pH도 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 시험용수의 DO는 무처리군에서 8.24 ± 0.03 (8.21 - 8.28)의 수준이였으며 들잔디를 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 및 20,000 mg·L-1의 농도로 처리한 후의 용존산소량은 8.23 ± 0.02, 8.23 ± 0.01, 8.21 ± 0.01, 8.21 ± 0.02 및 8.18 ± 0.01로 측정되었다. 또한 JG21 잔디의 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg·L-1 처리구에서는 각각 8.25 ± 0.03, 8.21 ± 0.02, 8.17 ± 0.03, 8.17 ± 0.03 및 8.13 ± 0.03로 측정되었으며, t-test 검정 결과 통계적 유의차는 없었다(Table 3). 수온은 들잔디와 JG21 잔디에 대하여 각각 23.3 ± 0.1℃ (23.1 - 23.5℃)와 23.3 ± 0.1℃ (23.1 - 23.5℃)로, 담수어류독성평가의 적정 수온인 20 - 25℃ (농촌진흥청 고시 제 2019-5호 기준)수준 내에서 시험 용수의 수온이 유지되었다(Table 4). 또한 수조 내 광도와 시험 용수의 시각적 특징을 각각 Table 5와 Table 6에 나타내었으며, 이는 처리구 간의 차이를 보이지 않았다. 이러한 측정결과를 바탕으로 본 실험에서 사용된 시험 용수의 pH와 DO 및 수온 등은 잉어 급성 독성 실험에 크게 영향을 미치지 않았음을 확인하였다.
Table 2.
Changes of pH during cumulative mortality tests of Cyprinus carpio in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Table 3.
Changes of DO (dissolved oxygen) during cumulative mortality tests of Cyprinus carpio in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Table 4.
Changes of water temperature (℃) during cumulative mortality tests of Cyprinus carpio in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Table 5.
Light intensity (lx) values of Cyprinus carpio after 0 and 96 h in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Light intensity (lx) | Observation time | |
0 h | 96 h | |
Non-GM grass | ||
Left | 974 | 976 |
Medium | 985 | 989 |
Right | 971 | 973 |
GM grass (JG21) | ||
Left | 971 | 974 |
Medium | 980 | 986 |
Right | 966 | 970 |
Table 6.
Appearance of test solution in the definitive test.
Concentration (mg·L-1) | Appearance (0 h) | |||
Color | Suspended solids | Floating solids | Precipitation | |
Non-GM grass | ||||
Controly | C-z | S- | F- | P- |
1,250 | C+ | S+ | F+ | P+ |
2,500 | C+ | S+ | F+ | P+ |
5,000 | C+ | S+ | F+ | P+ |
10,000 | C+ | S+ | F+ | P+ |
20,000 | C+ | S+ | F+ | P+ |
GM grass (JG21) | ||||
Control | C- | S- | F- | P- |
1,250 | C+ | S+ | F+ | P+ |
2,500 | C+ | S+ | F+ | P+ |
5,000 | C+ | S+ | F+ | P+ |
10,000 | C+ | S+ | F+ | P+ |
20,000 | C+ | S+ | F+ | P+ |
들잔디와 JG21 잔디의 처리 농도별 잉어 치사 개체 분석
담수어류의 급성 독성 평가는 일반적으로 96 시간 이내의 치사 개체를 비교함으로써 이루어진다(Bae et al., 2018). 본 연구에서는 들잔디와 JG21 잔디의 각 처리 농도(0, 1,250, 2,500, 5,000, 10,000 및 20,000 mg·L-1) 및 처리시간(24, 48, 72, 96시간)에 따른 잉어의 치사 개체수를 조사하였다. 5,000, 10,000 mg·L-1의 농도로 들잔디를 처리한 처리구에서 48시간 경과시 각각의 농도에서 3.3, 30.0%의 치사 개체가 관찰되었으며, 96시간 경과 후에는 각각 13.3, 53.3%로 증가한 치사율을 보였다. 20,000 mg·L-1의 들잔디 처리구에서는 48시간 이후에 모든 개체수가 치사한 것으로 관찰되었다(Table 7). JG21 잔디 처리구의 경우 5,000 mg·L-1 처리 농도에서 48시간이 경과한 후 6.6%의 치사 개체가 관찰되었으며, 10,000 mg·L-1 처리 농도에서는 30%의 치사율이 관찰되었다. 96시간 경과시 5,000, 10,000 mg·L-1 처리 농도에서 각각 16.6, 50.0%의 치사 개체가 관찰되었다. 들잔디 처리구와 마찬가지로 20,000 mg·L-1의 처리구에서는 모든 잉어 개체가 치사됨을 확인하였다(Table 7). 처리 기간 중 무처리군(0 mg·L-1), 들잔디와 JG21 잔디의 2,500 mg·L-1 농도 이하 처리구에서는 특이 증상 및 일반중독증상은 관찰되지 않았다. 들잔디와 JG21 잔디를 이용한 급성독성평가시험 종료 후 살아남은 잉어 개체의 체중 및 전장을 분석한 결과, 들잔디 처리구에서는 각각 0.63 ± 0.06 g 및 3.5 ± 0.2 cm, JG21 잔디 처리구에서는 각각 0.63 ± 0.05 g 및 3.5 ± 0.1 cm로 측정되었으며 처리구 간의 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Table 8).
Table 7.
Cumulative mortality of Cyprinus carpio in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Table 8.
Body weight and total length of Cyprinus carpio after 96 h in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Test item | Body weight (g) | Total length (cm) |
3,5-Dichlorophenol (reference substance) | 0.36 ± 0.03a | 2.7 ± 0.1a |
Controlz | 0.63 ± 0.07b | 3.5 ± 0.1b |
Non-GM grass | 0.63 ± 0.07b | 3.5 ± 0.2b |
GM grass (JG21) | 0.63 ± 0.05b | 3.5 ± 0.1b |
들잔디와 JG21 잔디의 급이에 의한 잉어에 대한 급성독성
들잔디와 JG21 잔디의 잉어 급성 독성시험을 수행한 결과, 들잔디의 48 h-LC50은 11,220 mg·L-1, JG21 잔디의 48 h-LC50은 10,670 mg·L-1로 분석되었으며, 들잔디의 96 h-LC50은 8,791 mg·L-1, JG21 잔디의 96 h-LC50은 8,977 mg·L-1로 분석되었다(Table 9). 모든 처리구 간의 수치는 95% 신뢰한계 구간 내 유의성이 없는 것으로 나타났다(Table 9). 이는 PAT 유전자가 도입된 JG21 잔디가 대조구인 들잔디와 비교하였을 때, 잉어에 미치는 영향에 차이가 없음을 시사한다.
Table 9.
LC50 (lethal concentration 50) values of Cyprinus carpio after 48 and 96 h in non-genetically modified zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) and herbicide resistance transgenic zoysiagrass (JG21).
Test item | LC50 (mg·L-1) | |
48 h | 96 h | |
3,5-Dichlorophenol (reference substance) | 1.983 (1.773 - 2.226)z | 1.752 (1.567 - 1.955) |
Non-GM grass | 11,220 (9,910 - 12,710) | 8,791 (7,548 - 10,250) |
GM grass (JG21) | 10,670 (9,230 - 12,340) | 8,977 (7,700 - 10,480) |
Conclusion
본 연구에서는 JG21 잔디에 도입된 유전자의 발현을 검증하고, 어류 생물종인 잉어에 미치는 영향을 모품종인 들잔디와 비교 분석하였다. 이 연구를 통해 PAT 유전자가 포함된 JG21 잔디가 모품종인 들잔디와 시험 조건에서 비표적 생물체인 잉어에 미치는 영향이 없음을 확인하였다. 잉어의 급성 독성 시험 중 모품종인 들잔디와 JG21 잔디 사이의 체중, 전장, 시험 용수의 pH와 수온 및 DO에 유의적인 차이가 없었으며, 잉어에 영향을 미칠 수 있는 외부적인 요인은 발견되지 않았다. 따라서 본 연구 결과는 시험 조건에서 들잔디와 JG21 잔디가 잉어에 미치는 영향 사이에 차이가 없음을 보여준다.
어류를 이용한 독성 위해성 평가는 급성 독성 평가에 따른 치사율을 비교하는 것 외에도 조직학적인 비교 또는 혈액학을 기반으로 한 요소들의 비교 평가 등으로 이루어질 수 있다(Jeong et al., 2022). 따라서 본 연구에서 이루어진 급성 독성 평가 결과를 기반으로 기타 요소들의 평가 연구가 필요할 것이다. 또한 GM 잔디의 환경위해성 평가를 위해서는 수서환경생물종인 잉어 이외에도 다양한 비표적 농업환경생물종에 대한 독성 영향 분석이 이루어져야하며, 농업 생태계에 미치는 영향에 대한 연구 기준과 가이드라인을 구축할 필요가 있다. 본 연구의 결과는 이에 대한 기초 자료로써의 활용 가치가 있을 것으로 판단된다.