Seed germination and bio-luminance inhibition assay for ecotoxicity of selenium
© 2024 Korean Journal of Agricultural Science
ABSTRACT
Introduction
Materials and Methods
시약 및 표준 용액
발광 미생물 독성 시험
발아 시험을 위한 종자 선정
종자 발아 시험
통계분석 방법
Results and Discussion
발광미생물을 이용한 Se의 독성 평가
Se 농도에 따른 종자별 발아율
Conclusion
Introduction
셀레늄(Se)은 인체 필수 미량 원소이며 강력한 항산화 효과, 노화방지 및 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Rayman, 2000; Navarro-Alarcon and Cabrera-Vique, 2008). 하지만 Se은 독성과 비독성의 용량 차이가 매우 작아 섭취 시 주의를 기울여야 한다. 건강기능식품으로 주로 섭취되는 유기 Se은 무기 Se보다 인체 내 흡수 효과가 좋으며, 유기 Se을 효율적으로 섭취하기 위해서는 작물이 흡수한 Se을 섭취하는 것이 가장 효과적이다(Wolffram, 1999; Hadrup and Ravn-Haren, 2021; Lee et al., 2022). Se의 결핍 증상으로는 심장근육질환, 피부병변, 그리고 골격근 장애 등이 발생할 수 있으며, 과다섭취시에는 머리카락 및 손톱 손상뿐만 아니라 신경과 호르몬 장애가 발생할 수 있다(Chariot and Bignani, 2003; Kanekura et al., 2005; Zagrodzki and Łaszczyk, 2006; Kieliszek and Błażejak, 2016).
생태독성학적 측면에서 Se의 생태독성 평가에 대한 결과를 살펴보면 발광미생물을 활용한 Microtox 만성 독성 실험에서 half-maximal inhibitory concentration (IC50), lowest observed effect concentration (LOEC)와 no observed effect concentration (NOEC)의 결과는 각각 114 µg·L-1, 67.6 - 135 µg·L-1와 33.8 - 67.6 µg·L-1 범위의 결과를 보였다(Hsieh et al., 2004). 또한 식물을 활용한 Se의 생태독성평가에서는 콩나물과 양배추를 대상으로 생체량 및 건중량을 조사한 결과 Se의 농도가 5 mg·L-1 이상일 경우 생장억제가 발생하였고, 3일차 발아 실험에서는 10 - 50 mg·L-1 농도에서 발아율이 감소하였다(Cheong et al., 2009; Won and Pak, 2018; Liu et al., 2024).
농업환경적 측면에서 한국의 농경지 토양은 Se 함량이 낮은 화강암이 모암이므로, 토양 중 Se 함량이 다른 국가들에 비해 현저히 낮다(Wells, 1967; Caple et al., 1980). 토양 내에서 Se은 주로 selenate (Se6+)와 selenite (Se4+)로 존재하며, Se 강화 작물 연구 시 주로 selenite를 이용한다(Lee et al., 2005; Stroud et al., 2010; Won and Pak, 2018; Wang et al., 2019). Selenite는 무기 Se의 형태 중 작물 흡수가 용이한 반면 독성이 큰 단점이 있다(Hopper and Parker, 1999; Hawrylak-Nowak, 2013; Kikkert and Berkelaar, 2013). 따라서, 농업 환경에서 Se을 활용하기 위해서는 Se의 생태독성에 대한 영향평가가 중요하며 본 연구에서는 Se이 작물의 발아에 미치는 영향과 발광미생물의 활성 저해도를 측정하여 Se의 생태독성을 평가하였다.
Materials and Methods
시약 및 표준 용액
종자 발아 시험과 발광 미생물 독성 시험에 사용된 Se의 표준 시료는 sodium selenite (Na2SeO3, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 표준 용액 100 mg·L-1를 조제 후 냉장 보관하였으며 초순수 증류수를 이용하여 독성 평가 시 각각 알맞은 농도로 희석하여 사용하였다.
발광 미생물 독성 시험
미생물 독성 평가는 발광 미생물(Vibrio fischeri)을 이용한 Microtox® (Model 500, Modern Water, USA) 급성 독성 평가를 실시하였다. 분석에는 81.9% basic test를 적용하였으며, 제조사에서 제공하는 프로토콜을 참고하여 진행하였다(Johnson, 2005). 발광 저해율(inhibition effect, %)은 Se 용액 투입 전인 미생물의 초기 발광도(I0)와 Se 투입 후 5분과 30분 뒤의 후기 발광도(It)를 각각 측정하여 미생물의 발광 저해율을 측정하였으며(식(1)), 발광 저해율이 30%를 넘지 않으면 물질의 독성이 없다고 판단하였다(NIFS, 2023).
: initial luminescence
: late luminescence
: luminance ratio coefficient between and ()
발광미생물의 정도관리는 zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O, Samchun Pure Chemical, Korea) 표준 독성 물질 시험을 통해 30분 최대 유효 농도의 절반(EC50) 값이 1에서 10 mg·L-1의 범위에 통과하는 것을 기준으로 확인하였으며, 초기 발광량에 비해 후기 발광량의 비율(Rt)이 0.6 - 1.8의 범위에 포함되어야 한다(NIFS, 2023).
발아 시험을 위한 종자 선정
종자 발아 시험에 사용된 종자는 쌍자엽식물인 무(Raphanus sativus), 배추(Brassica rapa), 양배추(Brassica oleracea)와 단자엽식물인 파(Allium fistulosum), 양파(Allium cepa) 총 5가지 종자를 선정하였다. 선정 기준은 농림축산식품부에서 제공하는 2021년 기준 채소류 생산실적 중 생산량 10위 내의 채소로 하였다(MAFRA, 2021). 각각의 종자들은 육안으로 외관상 상처가 없는 종자로 선별하여 사용하였다.
종자 발아 시험
종자 발아 시험의 조건은 선행연구를 바탕으로 설정하였다(Jung et al., 2020; Hwang et al., 2022; Kim et al., 2023a; Oh et al., 2023). 종자는 배양중 번식하는 균류를 제거하여 균에 대한 발아영향이 없도록 3% H2O2로 소독한 뒤 2일간 건조 후 사용하였다. 종이배지(ADVANTEC No. 2, 90 mm)에 종자를 30립씩 배치한 뒤 Se 농도 별(0, 1, 5, 10, 25 및 50 mg·L-1) 6개 처리구로 하여 각각 5 mL씩 첨가하고, 대조구(0 mg·L-1)에는 증류수를 5 mL첨가하였다. 수분 증발을 막기 위해 밀봉하여 배양기(JSPC-420C, JS Research Inc., Korea)에서 배양하였다. 생육상의 온도와 습도는 각각 25℃, 85%로 설정하였으며, 명조건과 암조건을 각각 12시간씩 설정하였다. 발아 조사일은 배양 시작 후 3일(72시간)로 정하여 발아된 묘를 조사하였다. 발아된 묘의 기준은 쌍자엽식물은 자엽이 나타난 묘, 단자엽식물은 유근이 1 mm 이상 나타난 묘를 기준으로 발아를 확인하였다. 실험은 3반복 실시하였으며, 발아율(germination rate, GR [%])은 식(2)를 활용하여 산출하였다.
: number of germinated seeds
: number of seeds initially placed
통계분석 방법
모든 시험은 3반복 시행 후 평균과 표준편차 값으로 표시하였으며, statistical package for social science (SPSS) version 26.0 (SPSS Inc., USA)을 이용하여 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 평균값의 통계적 유의성을 검정하였다(Kim et al., 2023b).
Results and Discussion
발광미생물을 이용한 Se의 독성 평가
Microtox® M500의 81.9% basic test protocol을 이용하여 Se 표준 용액(100 mg·L-1)에 대한 5분과 30분의 독성 평가를 실시하였다(Fig. 1). 전체적으로 발광미생물의 발광량은 초기 발광량에 비해 시간이 지난 후기 발광량의 값이 증가하는 경향이 있었으며, Rt는 5분 독성평가에서 1.5, 30분 독성평가에서 1.7로 시험 결과로 사용하기 적합한 수준이었다. 또한 독성평가의 신뢰성 확보를 위한 zinc sulfate heptahydrate 표준 독성 물질 시험 결과 Rt 값은 1.4이였으며, 30분 EC50 값이 1 - 10 mg·L-1의 범위에 통과하는 것을 확인하였다. 독성 평가 결과 Se 농도가 증가함에 따라 저해율이 높아지는 것이 확인되었으나, 5분 독성 평가 결과 저해율이 30% 이상인 농도가 81.9 mg·L-1부근이었으며, 30분 독성평가에서는 저해율이 30% 이상인 값이 없어 발광 미생물에 대한 Se의 독성은 약한 것으로 나타났다. 하지만 5분 독성 평가 결과 중 81.9 mg·L-1의 농도에서 독성이 나타난 것을 보아 Se 고농도 처리 시 급성 독성이 나타날 수 있다고 판단되었다. 또한, 30분 독성 평가에서는 독성이 나타나지 않는 결과를 바탕으로 Se는 노출 시간에 따라 독성 반응이 다르게 나타나는 것으로 판단되었다. 이는 Selmani 등(2020)의 연구와 동일한 결과로 Se 자체 만으로는 30분 독성이 나타나지 않았지만, 다양한 종류와 결합한 Se 나노 입자의 경우는 독성이 크게 나타날 수 있다. 물벼룩(Daphnia magna)을 대상으로 Se의 독성 실험을 한 Halter 등(1980)의 선행연구에서는 물벼룩이 Se에 노출되었을 때 급성 독성에는 민감하게 반응하는 모습을 보였지만, 만성 독성에 있어서는 강한 내성을 지닌 것으로 결과가 도출되었다. 이를 통해 Se의 독성은 노출 시간에 따라서도 다르게 나타나는 것으로 보였다.
Fig. 1.
Microtox bioassay results expressed as a percentage of the inhibition effect of Vibrio fischeri after 5- and 30-min exposure to zinc (control) and selenium.
Se 농도에 따른 종자별 발아율
쌍자엽 식물에 해당하는 무, 배추, 양배추의 경우 자엽이 생성된 묘를 기준으로 배양 시작 3일 후에 발아율을 확인하였다(Fig. 2). 무와 배추의 경우 10 mg·L-1 처리구 까지는 100%의 발아율이 관찰된 반면, 양배추의 경우 1 mg·L-1 처리구를 제외하고는 발아율이 15.6%에서 100.0%의 범위로 조사되었다. 무와 배추는 25 mg·L-1에서부터 발아저하가 나타났으며, 양배추는 5 mg·L-1처리구에서부터 Se에 대한 영향으로 발아가 저하되기 시작하여 25 mg·L-1부터는 배추와 비슷한 수준으로 발아가 저하되는 것을 확인하였다. 배추와 양배추의 50 mg·L-1 처리구 발아율은 각각 17.8%, 15.6%로 현저히 낮았으나, 무에서는 83.3%의 발아율로 배추와 양배추에 비해 상당히 높은 것으로 조사되었다. Cheong 등(2009)의 연구에 따르면 쌍자엽식물 4종류(배추, 상추, 청경채 그리고 갓)를 이용하여 Se 발아 실험을 실시한 결과 본 연구의 3일차 결과와 마찬가지로 50 mg·L-1에서 약 20% 이상의 발아가 억제되는 등의 발아율 저해를 나타내었다.
Fig. 2.
Seed germination rate of dicotyledon: Raphanus sativus, Brassica rapa, and Brassica oleracea. The whisker plots represent mean ± standard deviation (n = 3). Values with different letters are significantly different at p < 0.05 (one-way ANOVA).
단자엽식물에 해당하는 파와 양파의 경우 자엽을 확인하기 어려워 유근이 1 mm 이상 나타난 묘를 기준으로 쌍자엽식물과 동일하게 배양 시작 3일 후에 발아율을 확인하였다(Fig. 3). 파의 경우 발아율이 무처리구에서부터 고농도 Se 처리로 갈수록 94%에서 88%까지 점차 떨어지는 것이 확인되었다. 양파는 5 mg·L-1 처리구에서 가장 낮은 발아율인 83%를 보이다 점차 발아율이 증가하여 25 mg·L-1에서 91%로 조사되었으며, 50 mg·L-1에서 다시 발아율이 감소하여 88%로 나타났다. 단자엽 식물의 경우 50 mg·L-1의 농도에서 발아율이 파와 양파 모두 88%로 조사되어 쌍자엽 식물에 비해 Se의 독성이 미비한 것으로 조사되었다. 본 연구에서는 식물의 생리학적 특성에 따른 Se의 독성 메커니즘을 규명하지는 않았지만 본 연구의 결과를 바탕으로 작물의 종류에 따라 Se의 독성이 다름을 관찰하였다. 따라서 Se의 독성평가 자료를 농업환경에 활용하기 위해서는 작물별 Se의 농도가 미치는 독성 평가 연구가 필요할 것으로 판단하였다.
Fig. 3.
Graph of the germination rate of monocotyledon: Allium fistulosum and Allium cepa. The whisker plots represent mean ± standard deviation (n = 3). Values with different letters are significantly different at p < 0.05 (one-way ANOVA).
Conclusion
Se의 생태독성을 평가하기 위해 단자엽(파와 양파)과 쌍자엽(무, 배추, 양배추) 종자를 이용한 발아시험 및 발광 미생물(Vibrio fischeri)을 활용한 활동 저해 시험을 실시하였다. 시험 결과 단자엽 식물인 파와 양파는 유근 형성에 있어 Se의 독성이 미비한 반면 쌍자엽 식물인 배추와 양배추의 경우 50 mg·L-1처리구에서 17.8%, 15.6%의 현저히 낮은 발아율이 조사되었다. 작물의 종류에 따라 Se의 독성이 다르게 나타남을 확인하였으며 이를 농업환경에 활용하기 위해서는 Se에 대한 생물 유효도 조사와 보다 다양한 육상식물을 이용한 연구가 필요할 것으로 판단되었다. 발광 미생물을 활용한 생태 독성평가에서는 최대 시험 농도인 50 mg·L-1에서의 활성 저해율이 30% 미만으로 조사되어 발광미생물에 대한 급성독성은 미비한 것으로 판단된다.
Conflict of Interests
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Acknowledgements
This work was carried out with the support of “Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development (Project No. PJ015727)” Rural Development Administration, Republic of Korea. Also, the authors are greatly thankful for the support of SAP Analysis and Evaluation Cooperation.
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