Introduction
Materials and Methods
시험 약제 및 시약
시험 작물의 재배 및 약제 처리
시료 채취 및 가공
표준용액 제조, 표준검량선 작성 및 분석법상 정량한계
회수율 시험
농약의 잔류분석법
가공 계수
안전성 평가
Results and Discussion
검출한계 및 회수율
시험 농약의 잔류 특성
가공 계수
안전성 평가
Conclusion
Introduction
구기자(Lycium chinense)는 전통적으로 한약재 및 차 형태로 많이 이용되는 건강식품의 소재이다. 최근 식품의 기능성에 대한 관심이 증가하면서 구기자를 활용한 다양한 가공식품이 소비자들의 주목을 받고 있다(Lee, 2016). 구기자는 2023년 기준 재배 면적 138 ha, 생산량 479 ton으로 충남 지역을 중심으로 생산되며 2018년부터 생산량의 연평균 증가율은 14%로 매년 증가 추세를 보인다(KOSTAT, 2023). 구기자에는 betaine, linoleic acid, rutin, linolenic acid, threonine 등의 필수 아미노산, 다양한 비타민과 무기질을 비롯한 약효성분이 함유되어 있어 다른 생약류에 비해 효능이 높아 건강식품으로 우수한 작물이다(Lee et al., 2009; Kim et al., 2013).
구기자에 주로 발생하는 병은 열점박이잎벌레, 왕담배나방, 꽃노랑총채벌레, 뒷면곰팡이병, 구기자 뿔나방, 탄저병, 흰가루병 등이 있으며(RDA, 2024a), 이 중 구기자 뿔나방, 탄저병, 노균병과 같은 병의 방제를 위해 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron 3종의 농약이 주로 사용된다. Picoxystrobin은 strobilurin계 살균제로, 병원균의 세포 내 미토콘드리아에 존재하는 복합체 III: cytochrome bc1의 기능 억제를 유도하여 세포호흡을 억제하는 기전을 가진다(RDA, 2024b). 한편 benzoylurea계 살충제 flufenoxuron 및 teflubenzuron은 UDP-NAG (uridine diphosphate-N-acetylglucosamine)의 세포막 이동성을 저해하여 곤충 원표피(procuticle)의 중요 구성성분인 chitin 생합성을 저해하여 유충 단계에서 해충을 효과적으로 방제할 수 있다(RDA, 2024b).
구기자는 수분과 당을 많이 함유하여 쉽게 무르고, 부패가 쉽게 일어나는 특성을 가진다. 이를 방지하기 위해 주로 과실을 세척, 건조하여 보관 및 유통한다(Lee et al., 2010). 구기자의 건조는 일반적으로 농가에서 온습도 조절이 쉽고 노동력이 적게 소요되는 열풍건조 방법에 의해 수행된다. 열풍건조는 수분 제거 및 수분활성도 감소에 의해 미생물에 의한 부패 위험을 낮추어 식품을 장기 보존할 수 있게 한다(Kim et al., 2022). 하지만 건조 중 수분이 손실되어 중량 감소가 일어나 농산물 내 잔류하는 농약과 같은 위해 성분들의 농도가 증가할 수 있다(Lee et al., 2009).
식품의약품안전처에서는 농산물 및 식품에 대해 잔류하는 농약의 안전성 확보를 위해 잔류허용기준(maximum residue limit, MRL)을 설정하여 관리하고 있으며 현재 국내 생 구기자 및 건구기자에 설정된 농약 MRL은 각각 42종 및 41종이다(MFDS, 2024). 각 농약의 MRL은 해당 농약의 독성시험으로부터 얻어지는 일일섭취허용량(acceptable daily intake, ADI)과 비교하여 안전한 수준이어야 하며 이를 평가하기 위하여 MRL 수치에 식품 일일섭취량 및 몸무게를 대입하는 이론적인 최대섭취량(theoretical maximum daily intake, TMDI)을 산출하여야 한다(Kang et al., 2018). Common use principle (CUP) 이론에 따라, 산출된 TMDI 값은 해당 농약의 ADI 값의 80% 이내 수준에 있어야 한다(Lee, 2005).
본 연구에서는 구기자 재배 중 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron 3종 농약 성분의 잔류농도의 변화를 조사함과 동시에 수확된 구기자 일부를 실험실 내 열처리 가공한 후 변화되는 세 종 농약의 잔류농도를 평가하였다. 또한 건조 구기자 중 분석된 세 종 농약의 잔류농도를 이용한 %ADI를 평가하고, 생 구기자 중 농약 잔류농도로부터 건조 구기자 중 잔류농도를 추정할 수 있는 가공 계수(processing factor, PF)를 산출하였다.
Materials and Methods
시험 약제 및 시약
본 실험에서 사용된 약제는 picoxystrobin 25% 액상수화제(Acanto, Kyungnong, Korea), flufenoxuron 5% 분산성액제(Cascade, Sungbo Chemicals Co., Ltd., Korea) 및 teflubenzuron 5% 액상수화제(Nomolt, Kyungnong, Korea)로 모두 시중 농약 판매상에서 구입하였다. 성분별 구조식은 Table 1과 같다. 시험 농약의 표준품 picoxystrobin (1,003.0 µg·mL-1, Kemidas, Korea), flufenoxuron (1,002.5 µg·mL-1, Kemidas, Korea) 및 teflubenzuron (1,006.0 µg·mL-1, Kemidas, Korea)은 분석용 표준품을 사용하였다. 분석에 사용된 시약은 모두 HPLC grade를 사용하였다. 시료 분석 전처리에 사용된 QuEChERS 시약은 Kemidas 사(Korea)의 EN-QuEChERS Extraction kit (4.0 g MgSO4, 1.0 g NaCl, 1.0 g SCTD, 0.5 g SCDS), BEKOlut GmbH&Co.KG 사(Germany)의 PSA-dspe kit (150 mg MgSO4, 25 mg PSA)를 구매하여 사용하였고 기기 분석 시험에 사용된 이동상 용매는 Fisher Scientific 사(USA)의 methyl alcohol, Honeywell 사(USA)의 acetonitrile을 구매하여 사용하였고 이동상 조제에 사용한 formic acid와 ammonium formate는 모두 Sigma-Aldrich 사(USA)의 제품을 구매하여 사용하였다.
Table 1.
Chemical properties of the applied pesticide.
시험 작물의 재배 및 약제 처리
포장시험은 충남 청양군 운곡면 광암리 592-1에서 시설재배 조건으로 수행하였으며 처리구는 3 반복으로 배치하였다. 작물은 농가 관행 재배법에 따라 재배하였고 품종은 2년 수령의 화수로 하였다. 시험 포장에 처리한 약제는 picoxystrobin 2,000배, flufenoxuron 1,000배 및 teflubenzuron 2,000배 희석하여 7일 간격으로 각각 3회, 2회 및 2회 처리하였다. 전동식 분무기(MSB205Li, Maruyama, Japan)를 이용하여 약액이 흐를 정도로 충분히 살포하였다.
시료 채취 및 가공
최종 약제 살포 일을 기준으로 0일 차(살포 2시간 후), 7일 차 및 14일 차에 각 처리구 별로 생육 상태가 균일한 과실을 채취하였다. 수확한 시료를 시료 내용을 명기한 종이 시료 봉투에 담아 1시간 이내로 실험실로 운반하였다. 운반된 시료는 비식용 부위를 제거하고 생육 조사 후 전체 시료를 건조 전 생 구기자와 건조 후 건조 구기자 시료로 구분하였다. 생 구기자 시료는 PE 재질의 이중 지퍼백에 밀봉하여 -70℃ 급속 냉동시켰고, 건구기자 시료는 수확 당일 60℃ 식품 건조기(GN06, Hanil GNCO Co., Ltd., Korea)에 넣어 52시간 건조하였다.
표준용액 제조, 표준검량선 작성 및 분석법상 정량한계
Picoxystrobin (1,003.0 µg·mL-1), flufenoxuron (1,002.5 µg·mL-1) 및 teflubenzuron (1,006.0 µg·mL-1) 표준품을 각각 100 µg·mL-1의 primary stock solution으로 조제하였다. 상기 primary stock solution을 각각의 0.0025 - 10 µg·mL-1의 working standard solution으로 조제하였다. 이때, 희석 용매는 모두 acetonitrile을 사용하였다. 무처리 시료 전처리 용액을 이용하여 약제별 matrix-match 표준 용액을 제조하여 시료 분석 전후로 2회 분석하여 크로마토그램의 피크 면적을 기준으로 협착 표준 검량선을 작성하였다.
분석법상 정량한계(method limit of quantitation, MLOQ)는 최소 검출량, 시료량, 추출 용매량, 기기 주입량 및 희석 배수와 같이 분석법상의 전체 조작을 수행한 후 분석 대상 물질의 잔류농도를 정확히 판단할 수 있는 정량한계 농도를 말하는 것으로 아래의 식과 같이 산출하였다(식(1); Jeong et al., 2023).
회수율 시험
농약을 포함하지 않는 생 및 건조 구기자 무처리 시료에 농약 표준품을 정량한계 수준(0.01 mg·kg-1) 및 정량한계의 10배 수준(0.1 mg·kg-1)이 되도록 첨가한 후 잔류농약 분석 과정을 거쳐 회수율을 구하였다.
농약의 잔류분석법
마쇄한 생 구기자 시료 5 g에 acetonitrile 10 mL을 가하여 4분간 강하게 진탕하였다. 건조 구기자 시료 5 g는 증류수 5 mL로 습윤화 후 acetonitrile 10 mL을 넣고 homogenizer로 20,000 rpm에서 1분 동안 균질화하였다. 그리고 EN-QuEChERS extract kit와 ceramic homogenizer를 넣고 2분간 강하게 진탕 후 4,000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 수층을 분리하였다. 상징액 1 mL을 QuEChERS dispersive kit (150 mg MgSO4, 25 mg PSA)에 넣어 12,000 rpm으로 2분 동안 진탕 후 4,000 rpm으로 1분 동안 원심 분리하여 상징액을 0.2 µm syringe filter로 여과하였다. picoxystrobin 생 구기자 5배, 건조 구기자 10배 희석 후 5 µL 주입, flufenoxuron 생 및 건조 구기자 모두 5배 희석하여 3 µL 주입, teflubenzuron 생 및 건조 구기자 모두 2배 희석하여 5 µL 주입하였다. 희석 용매는 모두 acetonitrile을 사용하였다. 기기 분석 조건은 Table 2와 같다.
Table 2.
Conditions of liquid chromatography-tandem mass spectrometer (LC-MS/MS) for analysis of picoxystrobin, flufenoxuron, and teflubenzuron in Chinese matrimony vine.
가공 계수
가공 계수는 농산물 원료 중 농약의 잔류농도와 가공 후 농약 잔류농도의 비로 계산하였으며, 계산식은 다음과 같다(식(2); Kim, 2023).
건조 가공 중 pH에 따른 세 농약의 감소량을 확인하기 위해 pH 4 (formic acid 0.01%) 및 pH 9 (ammonium hydroxide 0.01%)의 용액에 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron 표준품을 1 mg·kg-1 농도로 제조하여 52시간 동안 60℃에 방치 후 잔류농도를 측정하였다.
안전성 평가
구기자에 대한 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron의 안전성 평가는 농산물 중 잔류농약의 위해성 평가를 위해 식품의 농약 잔류 허용 기준에 고시된 MRL과 국민 영양통계의 식품별 섭취량과 체중을 이용하여 TMDI를 산출하였다(식(3)).
식품의약품안전처의 잔류허용 기준에 등록된 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron의 ADI는 각각 0.043, 0.037, 0.01 mg·kg-1 ∙ bw·day-1이다. 이에 대한 TMDI의 비율로 %ADI를 산출하였다(식(4); Lim et al., 2024).
Results and Discussion
검출한계 및 회수율
시험 농약의 matrix-matched 표준품을 정량분석 하여 얻은 크로마토그램 상의 면적을 기준으로 작성된 검량선의 직선성과 상관계수(R2)는 0.997 이상으로 모두 양호하였다. 시험 농약의 분석법상 검출한계는 모두 0.01 mg·kg-1이었으며 회수율 시험 결과는 picoxystrobin 생 구기자 84.9 ± 8.1%, 건조 구기자 111.8 ± 5.2%, flufenoxuron 생 구기자 106.5 ± 6.5%, 건조 구기자 111.9 ± 2.8%, teflubenzuron 생 구기자 106.1 ± 3.2%, 건조 구기자 96.9 ± 9.2%로, 모두 식품의약품안전처의 기준인 70 - 120% 범위를 만족하였으며(MFDS, 2023) 변이계수 역시 9.5% 이하로 양호하였다.
시험 농약의 잔류 특성
구기자 시료 중 최종 약제 살포 후 경과일수를 다르게 설정한 시험 농약의 잔류농도는 Table 3에 제시되었다. 생 구기자 중 농약의 최대 잔류농도는 picoxystrobin 1.02 mg·kg-1, flufenoxuron 0.61 mg·kg-1 및 teflubenzuron 0.57 mg·kg-1이었으며 건조 구기자 중 농약의 최대 잔류농도는 picoxystrobin 4.36 mg·kg-1, flufenoxuron 2.89 mg·kg-1 및 teflubenzuron 2.20 mg·kg-1이었다. 공통적으로 최종 약제 살포 후 일자가 경과될수록 잔류농도가 경시적으로 감소하였으며 건조 과정을 거치며 잔류농도는 크게 증가하였다. Im과 Ji (2016)는 자두, 체리, 망고, 포도의 건조에 의한 가공 계수는 평균 2.12, 5.1, 6.3, 2.53으로 특히 건포도 제조 과정 중 대부분의 농약 성분이 농축되었다고 보고하였으며, Choi 등(2024)은 flubendiamide의 잔류량이 건조 전 대파는 0.1 - 0.2 mg·kg-1인 반면, 건조 후 대파는 0.7 - 1.3 mg·kg-1으로 더 높았음을 보고하였다. 이러한 선행 연구들의 결과와 본 연구에서 확인된 구기자의 건조 과정 중 약제 잔류 특성은 유사한 양상을 보였다.
Table 3.
Residual concentrations of pesticides in fresh and dried Chinese matrimony vine.
생 구기자의 0일 차 잔류농도와 14일 차 잔류농도를 비교했을 때 picoxystrobin의 경우 0일 차 1.02 mg·kg-1에서 14일 뒤 0.40 mg·kg-1으로 61%감소하였고, flufenoxuron의 경우 0일 차 0.61 mg·kg-1에서 14일 뒤 0.40 mg·kg-1으로 34%감소하였고, teflubenzuron의 경우 0일 차 0.57 mg·kg-1에서 14일 뒤 0.34 mg·kg-1으로 40%감소하였다. 14일 간의 잔류농도 감소 폭은 picoxystrobin이 flufenoxuron과 teflubenzuron에 비해 약 1.5배 더 크다는 것을 확인할 수 있다. 이는 flufenoxuron과 teflubenzuron이 광분해에 대해 상대적으로 안정적이며, 자외선에 의해 쉽게 분해되지 않는 특성(MFDS, 2018)을 가지는 반면, picoxystrobin은 살포 후 작물의 표피층에 강하게 부착되어 초기 잔류농도는 높지만 광분해에 민감하여 자외선에 의해 비교적 빠르게 분해되어 잔류농도의 감소 폭이 상대적으로 더 큰 것으로 판단된다(Ma et al., 2023).
가공 계수
생 구기자와 건조 구기자의 수분 함량은 각각 평균 83%와 17%로 나타났다(Table 4). 구기자의 농가 관행에 따른 열풍 방식의 가공 과정 중 수분이 약 66% 감소한 것을 알 수 있다. 이러한 가공 과정을 통해 증발하는 수분의 함량은 작물 중 농약의 잔류농도 변화에 밀접한 관련이 있다는 결과가 보고된 바 있다(Lee et al., 2010). 생 구기자와 건조 구기자 시료의 잔류농도를 분석하여 산출식을 통해 가공 계수를 계산한 결과 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron 각각 3.35, 4.75, 3.85이었다(Table 5). 이러한 현상은 건조 과정 중 농약의 분해 속도보다 농축 속도가 더 빠르기 때문에 발생하는 것으로 판단된다(Liu et al., 2023). 이와 같이 건조 과정을 통해 농산물 내 잔류하는 농약의 양이 3 - 5배 높은 상태로 유통될 수 있기 때문에 가공 과정을 거친 농산물에 대해서는 잔류농약의 가공 계수 시험 결과가 정확하게 평가되어야 할 것으로 사료된다.
Table 4.
Moisture content of Chinese matrimony vine.
Table 5.
Processing factors of pesticides in Chinese matrimony vine by drying.
Pesticide | Processing factors |
Picoxystrobin | 3.35 |
Flufenoxuron | 4.75 |
Teflubenzuron | 3.85 |
Picoxystrobin은 25℃의 저온의 경우 pH 5 - 9, 50℃의 고온의 경우 pH 4 - 7 범위에서 가수분해가 발생하지 않으며(JMPR, 2012) flufenoxuron은 pH 5 - 7에서 가수분해가 거의 발생하지 않고(JMPR, 2014), teflubenzuron은 pH 5 - 7에서 30일간 가수분해가 일어나지 않는다(JMPR, 1996). 구기자의 pH는 4.65 - 4.98로 보고된 바 있으며(Yu and Jin, 2011), 각 농약 성분의 가수분해 특성을 고려할 때 구기자의 낮은 pH 환경에서는 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron의 분해가 잘 일어나지 않기 때문에 가공 계수가 높게 나타난 것으로 추정된다.
열처리 가공 중 pH에 따른 세 농약의 분해 특성 실험 결과 세 약제 모두 공통적으로 60℃의 약산성 환경(pH 4)에서 안정적으로 존재하는 것을 확인하였다(Fig. 1). Picoxystrobin은 모든 조건에서 검량선 대비 91.6 - 102.8%였으며 pH에 따른 큰 변화는 나타나지 않았다. Flufenoxuron은 pH 4에서 103.1%, pH 9에서 23.5%였으며, teflubenzuron은 pH 4에서 117.4%로 안정적으로 존재하였으나 pH 9에서 0.0025 mg·kg-1 미만으로 검출되지 않았다. 이는 구기자의 약산성 환경이 세 농약의 안정성에 영향을 미쳐 가공 과정에서 수분 감소에 따른 잔류농도의 증가를 야기했음을 시사한다.
60℃, 36시간의 동일한 건조 가공 조건에서 methoxyfenozide의 가공 계수는 홍고추에서 3.11, 대파에서 3.95이었으며 indoxacarb의 경우 홍고추에서 3.35, 대파에서 2.56이였다(CBNU, 2006). 이처럼 동일한 농약이라도 작물에 따라 서로 다른 가공 계수를 보이는 경향이 있으며, 이는 가공 과정을 거치는 동안 작물의 특성과 농약의 이화학적 특성이 농약의 잔류성에 영향을 미치는 것으로 보여진다.
안전성 평가
전체 식품 중 잔류농약의 섭취 가능 최대량은 국민 평균, 유아, 고령, 임산부의 4개 그룹 각각에서 이론적 TMDI가 ADI의 80%를 초과하지 않도록 통제된다(MFDS, 2017; KCPA, 2013). 국민영양통계(KHIDI, 2021)에 구기자의 일일섭취량은 제시되지 않아 약용법을 참고하여 건조 구기자의 일일섭취량을 20 g으로 설정하였다. 구기자는 생과 건조 형태로 모두 섭취할 수 있지만, 주로 건조된 형태가 소비된다는 점을 고려하여 건조 구기자만 포함하였다.
본 실험 결과에 따른 생 구기자 및 건조 구기자의 7일 차 잔류농도를 사용한 %ADI 계산 결과 각 그룹에서 picoxystrobin 12.6 - 17.2%, flufenoxuron 20.5 - 27.1% 및 teflubenzuron 39.5 - 52.4%로 모든 그룹에서 80%를 초과하지 않았다. 이는 하루 동안 각 약제에 등록된 모든 식품을 섭취하더라도 모든 그룹에서 안전하다는 것을 의미한다(RDA, 2020). 따라서 안전사용 기준은 picoxystrobin은 수확 7일 전까지 3회 살포, flufenoxuron, teflubenzuron은 수확 7일 전까지 2회 살포가 적절한 것으로 판단된다.
Conclusion
본 연구에서는 구기자의 건조 과정에서 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron의 잔류 특성을 분석하고 안전성을 평가하였다. 연구 결과, 생 구기자의 잔류농도는 시간 경과에 따라 감소하였으며 14일 차와 0일 차를 비교했을 때 picoxystrobin은 60.78% 감소하여 flufenoxuron (34.43%) 및 teflubenzuron (40.35%)보다 큰 감소 폭을 보였다. 이는 picoxystrobin이 두 약제와 달리 광분해에 민감하여 자외선에 의해 빠르게 분해된 것으로 판단된다. 또한 건조 과정 후 농약의 잔류농도는 약 4배 증가하는 것을 확인하였다. 상기 3가지 약제에 대한 가공 계수 산출 결과는 각각 3.35, 4.75 및 3.85로 나타났다. 이는 건조 과정 중 구기자의 수분 함량이 약 66% 감소함에 따라 농약 성분이 농축된 결과로 해석되며, 기존 연구에서 건조 과정이 농약 잔류농도의 증가에 영향을 미친다는 것과 일치하는 결과이다. 60℃에서 pH에 따른 농약의 분해 특성을 시험한 결과 picoxystrobin, flufenoxuron 및 teflubenzuron 모두 약산성 조건(pH 4)에서 안정적으로 존재하는 것을 확인하였다. 이는 구기자의 약산성 환경이 농약 잔류에 영향을 미쳐 가공 과정 동안 잔류농도를 증가시키는 요인으로 작용했음을 보여준다. 본 연구는 구기자의 건조 및 가공 과정 중 농약의 잔류 특성을 분석하여 가공 과정에서 잔류농도가 크게 증가할 수 있음을 확인하였으며, 농산물의 안전성을 확보하기 위한 잔류 농약 관리 방안에 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.