Introduction

전 세계적으로 기후변화의 심각한 영향으로 농작물 생산에 중대한 피해가 발생하고 있다. 특히 가뭄은 토양 내 수분의 부족으로 인해 토양 침식 현상을 유발하며, 이는 작물 생산성의 저하시킨다. 이는 개발도상국과 같이 자연 강우에 의존하는 지역에서 생계에 직접적인 영향을 미친다(Myeong, 2014). 가뭄은 홍수나 저온보다도 작물에 더 큰 손상을 줄 수 있으며, 결과적으로 작물 수확량의 감소로 이어진다. 따라서 기후변화에 대응하여 작물 생산 시스템을 혁신해야 할 필요성이 절실히 요구된다(Lesk et al., 2016). 이러한 배경 속에서 안정적인 농작물 생산을 위한 새로운 접근 방식이 필수적이다.

국제연합식량기구(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)에 따르면 벼(Oryza sativa L.)의 연간 전 세계 생산량은 약 5억 500만 톤이며, 인구의 약 50%의 주식이다(FAO, 2021). 특히 벼는 아시아 지역에서의 소비가 두드러지며, 미네랄, 비타민, 아미노산, 식이섬유 등 다양한 영양소를 풍부하게 함유하고 있어 그 중요성이 더욱 강조된다. 따라서, 증가하는 소비수요를 충족하기 위해서는 쌀 생산성을 높이고 품질을 개선하는 데 초점을 맞춘 연구가 필수적이다(Rana et al., 2020).

유전자변형(genetically modified, GM) 작물 개발은 미래의 식량문제를 해결하기 위한 중요한 전략으로 주목받고 있다. GM작물은 환경 지속 가능성을 높이고, 재배 시 안전성을 개선하며, 최소한의 노동력과 생산비용 절감으로 수확량을 늘릴 수 있는 잠재력을 가지고 있다(Woo et al., 2014; Lee et al., 2015). 그러나 이러한 장점에도 불구하고, GM작물은 환경과 인간에 대한 잠재적 위험성을 초래할 수 있다는 점에서 신중한 접근이 필요하다(Jiang, 2020; Sim et al., 2023). 따라서 GM작물의 안전성 평가는 필수적이다. GM작물은 경제협력개발기구(Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD)에서 개발한 영양적 관점에 따른 작물별 지침 문서와 규정을 통해 환경 안전성 및 식품 및 사료 안전성을 평가할 수 있다(EFSA, 2006; FAO and WHO, 2009; Bedair and Glenn, 2020). 기존 연구에서 가뭄 저항성 GM벼에 대한 영양성분 함량의 실질적 동등성이 확인된 바 있으나(Lee and Cho, 2018), 본 연구에서는 OECD에서 규정한 GM작물의 안전성 평가 대상을 제외한 대사체에 대해 추가적으로 비교 분석하였고, 본 연구의 결과가 GM벼의 안전성 및 영양 평가에 대한 검토 자료로써 활용될 수 있음을 기대한다.

대사체학은 분석 화학과 생물정보학의 통합을 통해 생물학적 시스템을 종합적으로 특성화하는 것을 목표로 하는 프로파일링 기술이다. 액체크로마토그래피, 기체크로마토그래피와 같은 단일 분리 기술로는 전체 대사체를 특성화할 수 없어, 기체크로마토그래피를 통해 대사물질을 분리하고, 질량분석법을 통해 분리된 대사물질을 분석하는 등 결합된 분석방법을 이용한다. 질량분석법은 일반적으로 핵자기공명법 보다 더 높은 감도를 제공하며, 대사체에 대한 더 넓은 적용 범위를 갖고있다(Bedair and Glenn, 2020). 대사체학은 다양한 대사산물 간의 상관관계를 조사하여 대사 연관성에 대한 통찰력을 제공하며, 이는 생화학적 경로의 결과를 확인하는데 도움을 준다(Sim et al., 2023). 또한 주성분분석, 부분 최소 제곱 판별 분석, 계층적 군집 분석, 히트맵과 같은 다양한 다변량 통계 분석 기법은 다양한 생물학적 또는 기원적 차이를 갖는 시료를 분리하는데 널리 사용된다(Kim et al., 2014a).

가뭄 저항성 GM벼(Agb0103)는 일미벼를 모본으로 하여 고추유래 Capsicum annuum methionine sulfoxide reductase B2 (CaMsrB2) 유전자를 도입하여 개발되었다(Kim et al., 2014b). 고추유래 CaMsrB2 유전자는 생물학적 스트레스로 인한 메티오닌 산화 방어 조절자 역할을 한다고 보고되어 있다(Oh et al., 2010). 이 벼는 유묘와 성숙 단계 모두 가뭄에 강한 내성을 나타내어 기후변화에 대응할 수 있는 중요한 GM벼 계통으로 평가되고 있다(Oh et al., 2014). 이전 연구에 따르면, 가뭄 저항성 GM벼(Agb0103)와 일미벼의 주요 영양소와 항영양소를 비교한 결과, 두 품종 간 유의미한 차이가 없는 것으로 나타나 가뭄 저항성 GM벼가 일미벼와 영양적으로 동등함을 유지하면서(Lee and Cho, 2018), 가뭄 내성에 강한 특성을 지니고 있다.

본 연구에서는 가뭄 저항성 GM벼(Agb0103)와 일반품종 간의 대사물질 발현에 차이가 있는지를 확인하기 위하여, 가뭄 저항성 GM벼와 모 품종, 상업품종 5종에 대한 친수성 대사체 물질을 프로파일링하고, 다변량 통계 분석을 통해 비교 분석하였다. 친수성 1차 대사산물은 유기산, 아미노산, 당류 등을 포함하며 이는 생물체의 표현형과 밀접한 관련이 있으며 중요한 영양적 특성을 포함함으로(Hoekenga, 2008; Kok et al., 2008; Kim et al., 2013) 영양적 동등함을 비교함에 있어 중요한 대사체이다. 본 연구는 벼의 주요 대사산물의 지역 간, 연도 간 재배를 통해 GM 벼와 기존 품종 간의 차이를 검증하는 것이 목표이며, 기후 변화에 적응할 수 있는 작물 개발을 위한 분자 육종 소개를 평가하기 위한 기초 자료를 제공할 것으로 기대된다.

Materials and Methods

실험재료 및 준비

본 연구에 사용된 가뭄 저항성 GM벼는 일미벼를 모본으로 하여 고추(Capsicum annuum) 유래 CaMsrB2 (GenBank accession no. EF144171) 유전자가 삽입된 벡터(pSB-RbGW)를 이용하여 Agrobacterium을 통한 형질전환 방법으로 제조하였다(Kim et al., 2014b). 선발 마커로는 bar 제초제저항성 유전자를 사용하였으며(Fig. S1), T3세대까지 안정화 후 연구에 사용하였다.

비교품종으로는 중만생종에 해당하는 일미벼(모품종), 낙동벼, 동진벼, 남평벼, 칠보벼와 조생종인 운광벼 총 6종의 벼 품종을 사용하였다. 모든 벼 시료는 농촌진흥청 국립농업과학원 수원 LMO (living modified organism) 격리 포장(RDA-가A-2011-017)과 경북대학교 군위 LMO 격리 포장(RDA-가A-2011-005)에서 재배하였다. 재배 방법은 농촌진흥청의 표준재배법(RDA, 2012)을 참고하여 정식 밀도 30 × 15 cm로 설정하였다. 2012년, 2013년, 2014년 3개년도에 재배된 시료를 사용하였으며, 연구에 사용한 벼 품종은 년도별 차이가 있어 자세한 시료명은 Table S1에 표기하였다. 수확 된 벼 종자는 인습기(Rice Husker TR-130, Kett Electric Laboratory Co. Ltd., Japan)를 사용하여 왕겨를 분리한 현미를 유성형 볼밀(Pulverisette 6, Fritsch, Germany)을 이용하여 분말 형태로 가공하였으며, 이 후 -80℃ 초저온냉동고(DF8524, Iishinbiobase Co., Korea)에서 보관하였다. 분석은 각 품종당 3 회의 반복 실험으로 수행하였다.

친수성대사체 분석

친수성대사체 추출은 Jung 등(2022)의 방법에 따라 수행되었다. -80℃에서 보관된 현미 분말 10 mg을 2 mL 튜브에 정량한 후, 시료에 methanol : water : chloroform (2.5 : 1 : 1)용액 1 mL과 내부표준물질(internal standard, IS) adonitol 200 ppm 60 µL를 첨가하였다. 혼합물은 37℃, 1,200 rpm (161 × g), 30분 동안 Thermomixer (model 5355, Eppendorf AG, Germany)로 반응하였고, 원심분리기(MX-301, Tomy, Tokyo)를 이용하여 4℃, 13,290 rpm (16,000 × g), 3분의 조건으로 상층액(800 µL)을 분리한 후 새 튜브에 옮겨주었다. 분리된 상층액에 H₂O (deionized water) 400 µL를 첨가하고 4℃에서 13,290 rpm으로 3분간 원심분리하여 분리된 상층액(900 µL)을 새 튜브로 옮겨주었다. 이 후 상층액을 2시간 30분 동안 원심 농축한 후, 15시간 이상 동결 건조(FD8518, Iishinbiobase Co., Korea)하였다.

추출물의 유도체화를 위해 Methoxyamine hydrochloride (MOX, 20 mg·mL^-1) 80 µL을 동결건조한 시료에 넣고 30℃, 1,200 rpm (161 × g), 90분간 반응시켰다. 이후 N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) 80 µL를 첨가하여 37℃, 1,200 rpm (161 × g), 30분간 반응 시켰다. 유도체화 된 샘플은 GC (Agilent 7890A, Agilent, USA)와 연결된 Pegasus HT TOF mass spectrometer (LECO, USA)을 사용하여 친수성 대사체를 분리 및 동정하였다. 0.25 µm CP-SIL 8 CB로 코팅된 30 m × 0.25 mm 실리카컬럼(Varian Inc., USA) 사용하였고, split ratio는 1 : 25, 주입구 온도는 230℃, 이동상인 헬륨가스의 유속은 1.0 mL per min으로 실행하였다. 오븐 초기온도는 80℃에서 2분간 유지한 후 분당 15℃ 상승시켜 320℃에서 10분간 유지하는 조건으로 진행되었다. 대사체 동정은 ChromaTOF software version 5.50 (Leco, USA)와 보유하고있는 library 기반으로 하였다(Table 1). 동정한 대사체는 내부표준물질(IS)에 대한 피크 면적 비율로 나타내었다(Jung et al., 2022).

통계분석

본 연구는 시료별 3반복으로 분석하였으며, 데이터는 ANOVA 분석하였다(SAS 9.2 software, SAS Institute, USA). 상관관계분석은 표준화 처리를 통해 데이터를 정규화 한 후 수행하였고, 다변량 통계분석은 SIMCA-P 12.0 software (Umetrics, Sweden)을 이용하여 주성분분석(principal component analysis, PCA), 부분최소자승법(partial least squares of discriminant analysis, PLS-DA)을 수행한 후, 독립변수에 대한 종속변수(친수성대사체)들 간의 군집양상을 확인하였다. 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis, HCA)과 히트맵은 Multi-Experiment Viewer software version 4.4.0 (J. Craig Venter Institute, USA)으로 시각화하였다(Kim et al., 2013).

Results and Discussion

가뭄 저항성 GM벼, 일미, 참조 품종 간의 친수성대사체 주성분분석

2012년, 2013년, 2014년 3개년도의 가뭄 저항성 GM벼(Agb0103)와 모본인 일미벼, 참조 품종인 낙동벼, 동진벼, 남평벼, 운광벼, 칠보벼의 현미에서 동정된 대사체 물질들을 다변량분석으로 비교하였다. 각 품종당 43종의 친수성 대사체 물질이 동정되었고, 이 결과 값을 다변량 통계 분석하였다. 주성분분석(PCA)은 다변량 통계 분석 중 하나로 변수를 축약하는 분석방법 중 하나이다. X축을 나타내는 principal component (PC)1, Y축을 나타내는 PC2가 전체 데이터의 분산을 대표한다. 2012년 수원에서 재배된 PCA 결과 두개의 주요 components는 총 변이의 67.4% (PC1, 52.4%; PC2, 15.1%)를 반영하는 것으로 볼 수 있다(Fig. 1A). 참조 품종인 낙동은 PC2 기준으로 양의 값을 나타냈으며, 동진은 PC1을 기준으로 양의 값을, PC2를 기준으로 음의 값을 나타내었다. 가뭄 저항성 GM벼와 모본인 일미는 PC1과 PC2모두 음의 값을 나타내었다. 또한, 일미와 가뭄 저항성 GM벼는 군집화된 양상을 보인 반면에 참조 품종인 낙동과 동진은 각 품종별로 분리되었다. 이는 CaMsrB2 유전자 도입으로 인해 대사물질의 큰 변화는 주지 않으며, 벼 품종 간의 고유 특성에 따라 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 이 결과는 앞서 연구된 가뭄 저항성 GM벼와 모본인 일미 사이의 일반영양성분에서 유의한 차이가 발견되지 않았다는 연구결과와 일치함을 확인할 수 있었다(Lee and Cho, 2018). 2013년 수원 PCA결과는 두개의 주요 components가 전체 변이의 60.9% (PC1, 35.1%; PC2, 25.8%)를 나타내었다(Fig. 1B). 동진과 가뭄 저항성 GM벼, 일미(모본)의 PC2를 기준으로 음의 값을 나타내었으며 나머지 참조 품종은 PC1을 기준으로 양의 값을 나타내었다. 그래프에서 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본)의 위치는 비슷하며, 조생종인 운광은 확연히 분리되었고, 나머지 참조 품종은 분리되는 양상을 보였으나, 명확히 분리되지는 않았다. 2014년 수원 PCA결과 두 개의 주요 components는 전체 데이터의 47.7% (PC1, 27.2%; PC2, 27.2%)를 나타내었다(Fig. 1C). 참조 품종 5개와 일미(모본), 가뭄 저항성 GM벼가 그래프에 고루 분포되어 분산되었고, 조생종인 운광은 분리됨을 알 수 있었다. 2012년, 2013년, 2014년 수원지역 3개년도 전체 PCA결과 두 개의 주요 component는 전체 데이터의 40.8% (PC1, 22.5%; PC2, 18.3%)를 나타내었으며 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본), 참조품종간의 분리가 나타나지 않아 유의한 차이는 없음을 볼 수 있었다(Fig. 1D). 2013년 군위에서 재배된 가뭄 저항성 GM벼, 모본인 일미, 참조 품종인 낙동, 동진에 대한 PCA결과 두 개의 주요 components는 67.4% (PC1, 37.5%; PC2, 29.9%)를 나타내었다(Fig. 1E). 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본)는 PC1과 PC2를 기준으로 모두 양의 값을 나타내며 군집화된 양상을 볼 수 있었다. 낙동은 왼쪽 방면, 동진은 오른쪽 방면으로 서로 분리되었으며, 이는 수원 결과와 유사한 양상으로 보여졌다. 이와 같은 결과는 가뭄 저항성 GM벼와 모품종간의 대사체 함량이 재배지역에 상관없이 품종간 고유 특성에 따라 유지되는 것으로 해석된다. 2014년 군위 PCA결과 두 개의 주요 components는 전체 데이터의 50.8% (PC1, 32.9%; PC2, 17.9%)를 나타내었다. 5개의 참조 품종과 일미, 가뭄 저항성 GM벼는 분리되지 않고 분산된 양상을 보였으며 이는 2014년 수원과 유의미한 차이가 없다고 보여진다(Fig. 1F). 2013년 2014년 두 개년도, 군위지역 데이터를 합산한 PCA 결과 두 개의 주요 components는 전체 데이터의 45.4% (PC1, 29.9%; PC2, 15.5%)를 나타내어 분산되었음을 알 수 있지만, 모본인 일미와 가뭄 저항성 GM벼는 군집화된 양상을 보였다(Fig. 1G). 두 개 지역 3개년도를 총 합한 PCA 결과 두 개의 주요 components는 29.3% (PC1, 16.8%; PC2, 14.5%)로 낮은 값을 보였으며, 이는 품종별로 분리되지 않고 분산된 결과로 볼 수 있다(Fig. 1H). 최종적으로 친수성 대사체 물질의 PCA결과 가뭄 저항성 GM벼와 참조 품종 간 차이는 나타나지 않았고, 가뭄 저항성 GM벼는 일미(모본)과 비슷한 양상을 나타냈다. 또한, 중만생종과 조생종간의 차이도 나타나지 않았다. 이전 연구에서 수원, 익산, 밀양 3개 지역에서 재배된 레스베라톨 GM벼와 non-GM벼인 동진, 남평벼의 일반성분을 다변량통계분석 한 바 있으며, 본 연구와 동일하게 GM벼와 non-GM벼 간의 유의한 차이가 없음을 확인할 수 있었다(Kim et al., 2016).

Fig. 1.

Score plots of principal components 1 and 2 of the principal component analysis (PCA) results obtained from data on 43 metabolites of genetically modified (GM) rice (black circle), its isogenic counterpart (empty circle), and Nakdong (triangle), Dongjin (diamond), Nampyeong (star), Chilbo (inverted triangle), Unkwang (square) grown at Suwon in 2012 (A), 2013 (B), 2014 (C), and all of Suwon (D) and at Gunwi in 2013 (E), 2014 (F), and all of Gunwi (G) and all of the samples in this study (H).

가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본) 간의 대사체 비교 분석

PLS-DA는 부분최소자승판별법으로 독립변수에 대한 종속변수(친수성대사체)들 간의 관계를 찾아주는데 이용되며, PCA는 총 변동성 방향만 식별할 수 있는데 반해 PLS-DA는 ‘그룹 간’ 및 ‘그룹 내’ 차이를 더 잘 설명할 수 있다(Barker and Rayens, 2003). 2012년, 2013년, 2014년 3개년도 군위, 수원 지역에서 재배된 가뭄 저항성 GM벼와 일미의 총 데이터의 PCA결과 두 개의 주요 components는 52.5% (PC1, 29.7%; PC2, 22.8%)이며 품종 간 분리가 아닌 재배년도, 재배지역별로 군집화 된 것을 볼 수 있었다(Fig. 2A). 재배지역을 기준으로 일미와 가뭄 저항성 GM벼 사이의 차이를 설명하기 위하여 PLS-DA 분석한 결과 지역간 분리는 되었지만, 지역 내의 벼 품종간의 차이는 나타내어지지 않았으며 수원지역에서 재배된 벼는 군위지역에서 재배된 벼에 비해 군집화 된 양상을 보였고 가뭄 저항성 GM벼와 일미벼 간의 차이는 나타나지 않았다(Fig. 2B). 재배년도를 기준으로 PLS-DA 결과는 연도에 따라 군집화 되는 양상을 보였고 가뭄 저항성 GM벼와 일미벼 간 차이는 나타나지 않았다(Fig. 2C). 2013년 수원, 군위 지역에서 재배된 가뭄 저항성 GM벼와 일미벼 간의 일반성분 분석 결과 유의한 차이가 없다(Lee and Cho, 2018)고 보고된 이전 연구와 일치하는 결과이다. VIP (variable important in the projection)은 군집 간 차이를 설명해주는 지표성분으로 VIP 값이 1 이상인 성분들은 PLS-DA 결과에서 영향이 있다고 볼 수 있다(Park et al., 2014). PLS-DA 결과로 VIP값들을 확인할 수 있는데, 재배지역을 기준으로 분석한 결과에서는 aspartic acid가 가장 큰 값을 가지고, glutamic acid, glycine, alanine, fructose 등의 아미노산류가 두 그룹을 군집화 시키는데 영향을 미치는 것을 확인하였다(Fig. 3A). Aspartic acid는 필수 아미노산으로 알려진 methionine, threonine, isoleucine 등의 전구체이며, 식물 생장과 방어에 필요한 단백질, 뉴클레오타이드, 유기산, 아미노산 등의 생합성 경로의 핵심 요소로 알려져 있다(Han et al., 2021). 재배년도를 기준으로 분석한 결과에서는 glycerol, raffinose, tryptopane, shikimic acid 등이 군집화에 영향을 주는 것을 확인하였다(Fig. 3B). Tryptopane은 방향족 아미노산으로 단백질 생합성의 필수 성분이며, 식물의 성장과 발달, 환경적 반응 등의 주요 역할을 하는 옥신, 알카로이드 등의 식물의 이차 대사물질들의 전구체이다. 또한, shikimic acid는 방향족 아미노산과 이차대사산물의 생합성 연결 경로이다(Lim et al., 2015). 재배 지역, 재배년도에 따라 높은 값을 가지는 대사물질이 다름을 확인할 수 있었고, 주로 아미노산 또는 아미노산의 전구체임을 확인하였다.

Fig. 2.

(A) Score plot of principal components 1 and 2 of the principal component analysis (PCA) results obtained from data on 43 metabolites of genetically modified (GM) rice (filled symbols) and its isogenic counterpart (empty symbols) grown at Suwon (black symbols) and Gunwi (gray symbols) in 2012 (diamond), 2013 (triangle), and 2014 (circle). Score plots of the partial least squares of discriminant analysis (PLS-DA) results classified by growing locations (B) and years (C).

Fig. 3.

The metabolites ranked by variable importance by the projection (VIP) value with a threshold of 1.0 obtained from the partial least squares of discriminant analysis (PLS-DA) results that were classified by growing locations (A) and years (B).

벼 친수성대사체 계층적 군집 분석

HCA는 계층적 군집 분석으로 계층 구조에 따라 그룹 및 그룹 간 구성을 탐색하는 군집화기법이다(Lee and Yang, 2009). HCA의 결과는 덴드로그램으로 나타내며 생물의 구성과 관계를 트리형태로 보여준다. 또한, HCA는 식물 추출물의 생물학적 화합물과 생물학적 활성 간의 다변량 연관성을 평가하는데 널리 사용된다(Granato et al., 2018). 2012년, 2013년, 2014년 3년간 수원, 군위 두 지역에서 재배된 가뭄 저항성 GM벼, 모품종인 일미, 참조 품종의 결과를 한 번에 나타낸 그래프를 보면 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본)은 유사성이 높음을 나타내었다. 또한, 가뭄 저항성 GM벼, 일미(모본), 참조 품종은 모두 지역별로 유사성이 높음을 알 수 있었다(Fig. 4A). 2012년, 2013년, 2014년 3개년도 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본)간의 관계를 나타낸 그래프를 보면 크게 연차별, 지역별로 나뉘지만, 그 안에서는 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본)이 군집되어 둘 사이의 친수성 대사체물질간 차이가 두드러지지 않음을 알 수 있다(Fig. 4B). 결과적으로 가뭄 저항성 GM와 일미(모본) 품종 간의 차이는 유의하지 않으며, 연차별, 지역별 차이인 환경적요인이 벼의 친수성 대사체 물질에 더 큰 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 4.

(A) Hierarchical clustering analysis (HCA) results obtained from data on 43 metabolites of genetically modified (GM) rice (filled circle), its isogenic counterpart (empty circle), and commercial cultivars (triangle) grown at Suwon (black symbols) and Gunwi (gray symbols) for 3 years. (B) HCA results obtained from data on 43 metabolites of genetically modified (GM) rice (filled symbols) and its isogenic counterpart (empty symbols) grown at Suwon (black symbols) and Gunwi (gray symbols) in 2012 (diamond), 2013 (triangle), and 2014 (circle).

벼 친수성대사체들 간의 상관관계

벼 종자에서 추출된 43개의 친수성 대사체 물질들 간의 상관관계를 히트맵(heatmap)으로 시각화하였다. 상관관계분석은 두 표본 간의 생물학적 대사산물 사이의 연관성을 발견하는데 적용할 수 있다(Park et al., 2013). 히트맵은 물질들의 상관관계가 양의 값으로 밀접할수록 빨간색으로, 음의 상관관계를 가질수록 파란색으로 나타나며 관계가 밀접할수록 색이 짙어진다. 모본인 일미와 가뭄 저항성 GM벼 사이의 친수성 대사체 물질은 isoleucine, leucine, glycine과 같은 아미노산류들 사이의 양의 상관관계를 갖는다는 것을 확인할 수 있었고, aspartic acid, glutamic acid, shikimic acid 등 유기산류는 아미노산류와 서로 상반되는 음의 상관관계를 갖는다는 것을 알 수 있었다(Fig. 5A). 가뭄 저항성 GM벼 간 결과도 inositol, phenylalanine, isoleucine 등 아미노산류는 양의 상관관계를 갖고, glutamic acid, shikimic acid, lactic acid 등 유기산류가 음의 상관관계를 갖음을 나타내었다(Fig. 5B). Non-GM벼인 참조 품종과 가뭄 저항성 GM벼 간의 상관관계 역시 Fig. 5A와 Fig. 5B와 유사하게 isoleucine, leucine, alanine 등은 양의 상관관계를, shikimic acid, glutamic acid, aspartic acid 등은 음의 상관관계를 갖는 것으로 확인되었다(Fig. 5C). 이는 Kim 등(2013)의 연구에 따르면 벼 종자의 유기산류 대사물질은 일반적으로 다른 대사산물과 음의 상관관계를 나타낸다는 결과와 일치함을 알 수 있었다. 결과적으로 가뭄 저항성 GM벼, 모본인 일미, 참조 품종인 5종의 non-GM벼들 간의 친수성 대사물질간의 연관성에 대해 비교하였을때, GM벼와 non-GM벼 사이에 식별되는 특이점은 보여지지 않았다. 이 결과는 GM벼에 삽입된 도입유전자 CaMsrB2가 벼 종자에 함유된 친수성 대사산물에 영향을 미치는 않는 것으로 해석할 수 있다. 이를 바탕으로 본 연구는 추후 GM작물의 도입유전자와 non-GM 작물 내 친수성 대사산물 사이의 연관성 연구에 활용될 기초 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 5.

Correlation matrix and cluster analysis of results from data on 43 metabolites of genetically modified (GM) rice and its isogenic counterpart (A), GM rice (B), non-GM counterpart (C). Each square indicates the Pearson’s correlation coefficient for a pair of compounds.

Conclusion

OECD는 1993년 유전자 변형 식품을 평가하기 위한 지침 도구로 ‘실질적 동등성’을 공식화 하였고, 이는 기존 작물과 GM작물간의 유사점과 차이점을 평가할 수 있다(OECD, 1993). GM작물의 안전성은 알레르기 반응, 세포독성, 영양성분함량 등을 OECD참조 데이터와 비교하여 자연 범위 내에 있는지 여부를 평가하여 이루어질 수 있다(Kuiper et al., 2001). 대사체학은 오믹스 기술을 사용하여 GM작물의 생리학 및 대사의 잠재적 변화를 감지할 수 있으므로(Kim et al., 2022), Bedair와 Glenn (2020) 등은 GM작물과 non-GM작물에 대한 대사체연구를 활용한 안전성 평가의 중요성을 강조하였다.

본 연구에서는 고추유래 CaMsrB2 유전자가 도입된 가뭄 저항성 GM벼와 모본인 일미, 참조품종 5종에 대한 친수성대사체 분석을 통해 벼의 주요 대사산물의 지역 간, 연도 간 GM 벼와 기존 품종 간의 상대적 동등성을 확인하고자 하였다. 친수성 대사체 추출물을 기체크로마토그래프-질량분석기(gas chromatography–time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF-MS)를 이용해 각 샘플 당 총 43개의 대사물질들을 동정하였다. 이 결과를 토대로 주성분분석(PCA), 부분최소자승판별법(PLS-DA), 계층적 군집 분석(HCA) 등을 통해 다변량통계분석을 진행하였고, 히트맵을 통해 친수성 대사물질들 간의 상관관계를 시각화하였다. 실험에는 2012년, 2013년, 2014년 3개년동안 군위, 수원 두개 지역에서 재배된 벼 종자를 사용하였다. PCA분석 결과 가뭄 저항성 GM벼, 모본인 일미, 5종의 참조 품종을 비교하였을 때 일미(모본)와 가뭄 저항성 GM벼는 비슷한 양상을 보였다. 또한, 참조품종과도 유의한 차이는 보이지 않았고 품종간의 차이보다는 재배년도, 재배지역 등 환경적 요인에 영향을 더 받는 다는 것으로 분석되었다. PLS-DA의 결과, 품종의 차이보다는 재배 지역, 재배년도에 따라 VIP값이 1 이상으로 군집화에 영향을 미치는 대사물질들이 다름을 확인할 수 있었다. 이는 PCA결과와 비슷한 양상을 보임을 알 수 있었다. HCA결과도 마찬가지로 가뭄 저항성 GM벼와 일미(모본)의 유사성을 높으며, 환경적인 요인인 재배년도, 재배지역이 벼의 친수성 대사물질에 더 큰 영향을 주는 것으로 확인 되었다. 또한, 벼 종자의 43개의 대사물질들 간의 상관관계를 분석하여 시각화 한 히트맵 결과, 가뭄 저항성 GM벼, 일미(모본), 참조품종 모두 isoleucine, alanine 등 아미노산류는 서로 양의 상관관계를 가지고, glutamic acid, shikimic acid 등 유기산류는 음의 상관관계를 갖는다는 것으로 확인되었다. 이와 같은 분석 결과들은 기능성 GM작물의 친수성 대사물질들 사이 상관관계를 비교 분석하는 기초자료로 활용될 수 있는 것으로 판단된다.