Evaluation of the acute toxicity of Theoredoxin (TRX) transgenic soybean to Daphnia magna

PLANT&FOREST
Sung-Dug Oh1*Seok-Ki Min2Jae Kwang Kim3Jung-Ho Park4Chang-Gi Kim4Soo Yun Park1

Abstract

Theoredoxin (TRX) transgenic soybeans were developed using the human Theoredoxin gene under the control of the β-conglycinin promoter with a selection marker, the phosphinothricin acetyltransferase (PAT) gene. This study was done to assess the acute toxicity of a genetically modified (GM) soybean using the fresh water planktonic crustacean Daphnia magna. The acute toxicity effect of the TRX soybean and non-GM soybean (Gwangan) on D. magna was investigated at different concentrations (0, 156, 313, 625, 1,250, 2,500, and 5,000 mg·L-1). The TRX soybean used for the test was confirmed to express the TRX/PAT genes by PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). D. magna feeding tests showed no significant differences in the cumulative immobility or an abnormal response with either the TRX soybean or non-GM soybean. The feeding study showed a similar abnormal response and cumulative immobility of the D. magna between the TRX soybean and Gwangan treatments. Additionally, the 48 h-EC50 values for the TRX and Gwangan soybeans were 755.6 and 778 mg·L-1, respectively. The soybean NOEC (no observed effect concentration) value for D. magna was suggested to be 156 mg·L-1. These results suggest that there is no significant difference in toxicity to Daphnia magna between the TRX soybean and its non-GM counterpart.

Keyword



Introduction

동북아시아 지역이 기원지인 콩(Glycine max)은 단백질, 지질 등의 주요 영양 성분과 함께 이소플라본, 안토시아닌, 사포닌 등 다양한 기능성 성분들과 2차 대사산물들을 제공하는 세계 3대 주요 작물중 하나이다(Lee et al., 2011). 또한, 콜레스테롤 수치 완화, 혈관 질환 위험 요소 완화, 비만 예방, 암 예방 등과 같은 이점으로 인해 세계적으로 수요가 증가하고 있으며, 이에 따라 콩의 재배면적과 재배량이 증가되는 추세를 보이고 있다(Natarajan et al., 2013). 1996년 처음 재배된 GM (genetically modified) 콩은 전세계 재배 면적이 해마다 증가하여 2018년에는 95.8 백만 ha로 전세계 콩 재배 면적의 78%를 차지하고 있으며, 국내에서는 식품용으로 수입되는 양이 2019년에 1백만톤에 달한다(ISAAA, 2019; KBCH, 2020). 국내 GM작물 개발은 제초제저항성, 해충저항성, 영양강화 등의 다양한 기능성 유전자들 도입된 콩, 잔디, 벼, 배추, 고추, 감자 등의 작물에 연구 개발이 진행되었으며, 이중 일부 GM작물의 이벤트들에 대한 안전성 심사가 진행 중이나 산업용으로 승인되었으나, 아직까지 재배용으로 심사 승인되지 않았다(Oh et al., 2017; Oh et al., 2018; KBCH, 2019).

유전자변형생물체(genetically modified organism, GMO)에 대한 안전한 이용과 환경 위해성을 사전에 예방하기 위해서 각 나라별 상황에 적합한 GMO 안전 관리 체계를 구축하고 있다. GMO에 대한 국가 간의 안전관리와 협력를 위해 바이오 안정성 의정서(Cartagena Protocol on Biosafety) 국제협약을 체결하였으나, GM작물의 식품 섭취에 의한 인체 안전성, GM작물 재배지 생태계 및 주변 농업 환경 위해성에 대한 우려도 꾸준히 대두되고 있다(Lee and Suh, 2011).

국내에서도 2008년부터 시행된 ‘유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률(LMO법)’에 따라 GM작물의 연구개발, 운반, 보관 및 수출입의 전 과정이 국가적으로 관리되고 있으며, 특히 상업적 재배 승인에 앞서 위해성 평가가 필수적으로 수행되고 있다. GM작물의 위해성평가는 인체 안전성 평가와 환경 위해성 평가로 구분되는데, 환경위해성 평가시에 특히 도입 유전자 산물에 대한 표적 및 비표적 생물체에 미치는 영향, 유전자 이동성, 잡초화 등 안전성에 대한 입증이 필수 요소이다. 현재까지 국내에서 콩을 포함한 어떤 GM작물도 상업적인 목적으로 재배되고 있지 않지만, 염, 가뭄 등 환경스트레스 저항성 GM콩(Kim et al., 2017; Park et al., 2019), 영양 성분 강화 GM콩(Kim et al., 2012; Kwon et al., 2017) 등 GM콩 연구개발과 안전성 평가에 대한 여러 연구가 진행되고 있다(Oh et al., 2020).

GM작물에 도입된 유전자들의 발현 단백질들은 GM작물 내에서 유기화합물 유형으로 발현되어, 식물체내의 물질들 상호간의 작용에 대한 예측을 위해서는 발현 단백질이 생물종의 생체 기능의 상실, 치사, 및 신진대사의 감소 등에 미치는 영향을 비교 분석함으로써 유해성을 평가하는 환경생물 독성평가가 농업환경의 생태계 위해성을 분석하는 합리적인 방법으로 보고되고 있다(Kim et al., 2010). 환경생물독성 평가시에 여러 종류의 수서생물종들이 이용되는데 무척추동물로는 물벼룩(Daphnia, Daphnia magna), 옆새우(Gammarus), 가재(cray fish), 완미윤충류(Brachionus), 어류로는 잉어(Cyprinus carpio), 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus), 무지개송어(Oncorhyunchus mykiss), 자브라피쉬(zebra fish, Brachydanio rerio) 그리고 조류로는 Chlorella, Navicula, Selenastrum, microsystis 등이 일반적으로 평가에 이용되고 있다(Versteeg et al., 1997).

본 연구에서는 인간 유래 Theoredoxin (TRX) 유전자를 광안콩에 형질전환시킨 화장품 소재용 TRX 형질전환콩(Kakembo et al., 2017)이 물벼룩에 미치는 급성 독성 여부를 분석하기 위하여 TRX 유전자의 도입과 TRX 단백질 발현량을 확인한 후, 모품종인 광안콩과 함께 농업환경위해성 평가 항목인 물벼룩에 미치는 영향을 조사함으로써 GM콩에 대한 안전성 평가 자료 생산용 급성독성 영향 분석을 수행하였다.

Materials and Methods

시료 제조

본 실험에 사용한 TRX 형질전환콩은 Agrobacterium 형질전환법을 이용하여 모품종인 광안콩에 인간 TRX 유전자를 도입하여 개발한 것이다. TRX 유전자의 종자 특이 발현을 위해서 β-conglycinin 프로모터와 PinII 터미네이터가 이용되었다. 더블어 선발표지유전자로 bar 유전자도 도입되어 있어서 글루포시네이트(glufosinate)에 대한 저항성을 갖고 있다.

TRX 형질전환콩과 비형질전환 모품종인 광안콩을 국립농업과학원 LMO 격리 포장(2018년, 전라북도 전주시, RDA-가AB-2013-041)에서 재배하였으며, R6 발단 단계에서 줄기와 잎, 꼬투리 및 종자(시료비중 10%)를 수확하여 동결건조기(FD8518, IlsinBioBase, Yangju, Korea)를 이용하여 건조한 후, 분쇄기(HMF-3500SS, Hanil Electric, Seoul, Korea)를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 시료는 600 μm 표준망체(Chunggye sang gong sa, Seoul, Korea)를 이용하여 선별한 후, 물벼룩 사육용수인 M4 배지(Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany)에 현탁하여 물벼룩 급성독성 분석용 시료로 사용하였다.

게놈 DNA 추출 및 polymerase chain reaction (PCR) 검정

TRX 형질전환콩과 광안콩 식물체와 종자의 시료를 각 1 g씩을 측량하여 막자사발을 이용하여 시료를 분말화한 후, DNeasy Plant kit (Qiagen, Valencia, USA)을 사용하여 광안콩과 TRX 형질전환콩의 게놈 DNA를 추출하였다. NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, NC, USA)를 이용하여 추출된 게놈 DNA 정량하였으며, 260/280 nm의 수치가 1.8 - 2.0 사이인 게놈 DNA 시료를 PCR 실험에 사용하였다. TRX 형질전환콩에 도입된 T-DNA의 유전정보를 기반으로 TRX, bar (phosphinothricin acetyltransferase, PAT), lectin 유전자 검정용 프라이머를 제작하였다(Table 1). PCR 검정을 위하여 각 식물체의 게놈 DNA 20 ng에 프라이머 20 pM, 2X Hottaq PCR master mix 10 μL (Cellsafe, Yongin, Korea)을 첨가한 후 최종 반응 용량을 20 μL로 하였다. PCR 반응조건은 94℃ 5분 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분의 조건에서 35 사이클로 증폭한 후, 72℃에서 5분간 반응하였고, C1000TM Thermal cycler (Bio-rad, foster, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 합성된 각 검정 유전자들의 PCR 산물은 1% 한천겔에서 전기영동한 후 분석하였다.

Table 1. Primers list and sequence used for polymerase chain reaction (PCR) analysis. http://dam.zipot.com:8080/sites/kjoas/images/N0030470408_image/Table_KJOAS_47_04_08_T1.png

TRX , Theoredoxin gene; bar , phosphinothricin acetyltransferase (PAT) gene.

TRX 형질전환콩의 목적 단백질 발현 분석

bar (phosphinothricin acetyltransferase, PAT) 유전자의 발현 검정을 위하여 immunostrip 검정(lateral strip test)을 실시하였다. 광안콩과 TRX 형질전환콩의 시료에 추출액과 함께 분쇄하여 단백질을 용출한 후, bar 유전자의 단백질 발현을 Trait LL Test Strip (Strategic Diagnostics Inc, Newark, USA)을 이용하여 immunostrip 검정을 수행하였다. 광안콩과 TRX 형질전환콩의 TRX 단백질의 발현 농도를 분석하기 위하여 각 시료들을 분쇄한 후, PBST 용액과 함께 균질화하고 얼음에서 5분 처리하였으며, 5,000 g에서 원심분리를 5분간 수행한 후, 단백질을 분리추출하여 TRX ELISA Kit (Wuhan Fine biotech, Wuhan, China)를 이용하여 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)분석을 수행하였다. 모든 시료들은 상온에서 2시간 반응한 후 ELISA reader (Epoch, Bio-Tek, winooski, VT, USA)를 이용하여 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

물벼룩(Daphnia magna) 배양 조건

농업환경에서 수서환경의 생물종인 물벼룩(Daphnia magna)은 한국화학융합시험연구원(Hwasun, Korea)에서 사육 및 배양된 것을 이용하였다. 유리 비어커(1 L)에서 암조건 8시간(24:00 - 8:00), 광조건 16 시간(8:00 - 24:00), 수온 20 ± 2℃의 환경에서 사육하였다. Chlorella vulgaris (ATCC, Manassas, USA)을 순수 배양한 후, 물벼룩의 먹이원으로 매일 1회 급이하였고, 시험물질 처리후에는 먹이를 급하지 않았다. 시험용수와 사육용수는 ‘Daphnia sp., Acute Immobilisation Test, Annex 3 Elendt M7 and M4 medium’ (OECD TG202, 2004-04-13) 방법에 따라 제시된 M4 배지를 사용하였으며, 배지는 사용하기 전 2시간 이상 강하게 폭기 시켜 사용하였다.

물벼룩에 대한 시료 처리조건

광안콩과 TRX 형질전환콩의 각 시료에 대한 48시간 동안 유효농도 분석 결과 EC50값이 400 - 800 mg·L-1 범위 내에 포함된다는 예비 실험을 근거로 156, 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg·L-1 (설정농도, 공비 2)의 농도 조건에서 물벼룩에 대한 시료 처리를 하였다. 광안콩과 TRX 형질전환콩의 시료(0.156, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5 및 5 g)는 각각 1 L의 시험용수에 반복 처리하여 시험 용액(test solution)으로 조제하였다. 양성대조구로는Potassium dichromate (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)를 사용하였으며, 음성대조구는 M4배지를 사용하였다. 시험 물질 처리군는 생후 24시간 이내의 물벼룩을 대상으로 각 농도 당 10마리씩 3반복으로 수행하였다.

급성 독성 분석을 위한 조사항목

광안콩과 TRX 형질전환콩의 물벼룩에 대한 급성 독성을 확인하기 위하여 모든 시험 수조에 대하여 실험시작 후 24시간 및 48시간 경과 시에 유영저해 및 이상 증상 관찰을 실시하였다. 유영 저해 판정을 위해 시험 용액을 유리막대로 가볍게 저어준 후, 약 15초 동안 시험 용액의 흐름을 벗어나지 못하거나 유영하지 못하는 개체를 시험물질에 영향받을 것으로 판정하였다. 또한, 치사 개체도 유영 저해 개체에 포함하였다. 시험 물질 처리기간 중 시료 처리 직후와 종료 시의 각 처리구에 대하여 pH와 DO (dissolved oxygen)를 측정하였고, 수온은 매일 1회 측정하였다. pH와 DO 및 수온은 WTW 사의 Multi 9430 (WTW, Weilheim, Germany)를 이용하여 측정하였다. 반수영향농도(EC50, effective concentration 50)산출은 시험 결과를 바탕으로 CETIS (Version 1.9.3.0, Tidepool Scientific Software, Mckinleyville, USA) 프로그램을 이용하여 계산하였다. 시험물질 처리 후 24시간 및 48시간 EC50 (95% 신뢰한계)를 Probit method을 적용하였고, EC50을 산출하였다. 무영향농도(NOEC, no observed effect concentration)는 중독증상이 없고 유영저해가 발생하지 않는 최고 시험농도로 표시하였다.

Results and Discussion

TRX 형질전환콩의 분자생물학적 분석

물벼룩 급성 독성 평가에 이용된 화장품 소재용 TRX 형질전환콩은 종자 특이 발현을 위해서 β-conglycinin 프로모터를 이용하여 인간 유래 Theoredoxin 유전자를 광안콩에 도입하여 개발되었다(Kakembo et al., 2017). 화장품 소재용 TRX 형질전환콩과 모품종인 광안콩을 LMO 격리포장(2018, Jeonju, Korea)에서 재배한 후 수서환경 생물종인인 물벼룩에 대한 급성독성평가를 실시하였다.

물벼룩 급성 독성 평가에 사용된 시료들에 대한 TRX 유전자의 삽입을 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시한 결과 TRX 형질전환콩에서만 353 bp의 PCR 산물이 생성됨을 확인하였으며, 모품종인 광안콩에서는 미검출되었다. 선발마커인 bar (phosphinothricin acetyltransferase) 유전자도 TRX 형질전환콩에서만 105 bp 크기의 밴드가 검출되었고 광안콩에서는 밴드가 미검출되었으며, 콩 내재유전자인 lectin 유전자 PCR 분석에서는 TRX 형질전환콩과 광안콩에서 모두 414 bp의 산물이 검출됨을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 실험의 물벼룩 급성 독성 평가에 이용된 TRX 형질전환콩에 TRX 와 bar 유전자가 도입되었으며, 도입 유전자가 안정적으로 유지됨을 확인하였다(Fig. 1).

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Fig. 1. Confirmation of the T-DNA genes on the Theoredoxin (TRX) transgenic soybean and non-genetically modified soybean (Gwangan). M, 100 bp plus DNA ladder; N, non-genetically modified soybean (Gwangan); TRX, TRX transgenic soybean; TRX, Theoredoxin gene; bar, phosphinothricin acetyltransferase gene.

TRX 형질전환콩에서 PAT 단백질의 발현을 검정하기 위하여 항체를 이용한 LFST (lateral flow strip test)분석을 실시하였다. 2018년 국립농업과학원 LMO 격리포장에서 재배한 TRX 형질전환콩과 광안콩 시료를 PAT 단백질 확인용 항체가 표지되어있는 immunostrip을 이용하여 각 단백질 발현을 분석한 결과, TRX 형질전환콩에서만 특이적으로 단백질이 검출되었으며, 대조구인 광안콩에서는 단백질이 발현되지 않았다(Fig. 2). 또한, TRX 형질전환콩에서의 TRX 단백질 발현량을 ELISA법을 이용하여 분석한 결과 TRX 형질전환콩에서만 153 ± 27 ng·g-1 수준의 TRX 단백질이 발현되었으며 광안콩에서는 발현되지 않았다(Fig. 3).

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Fig. 2.Confirmation of genes expression for Theoredoxin (TRX) transgenic soybean by using immunostrip tests for the phosphinothricin acetyltransferase (PAT) detection. N, non-genetically modified soybean (Gwangan); TRX, TRX transgenic soybean.

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Fig. 3. Theoredoxin (TRX) protein levels (ng·g-1 dry weight) in non-genetically modified soybean (Gwangan) and TRX transgenic soybean. Values are the average ± SD of triplicate measures.

시료처리용 시험용수의 수질변화 검정

물벼룩 급성 독성 시험 분석을 위한 시험 용수의 수질 검사를 TRX 형질전환콩과 광안콩의 시료 처리 직후와 시험 종료 시에 각 처리구별로 수조내 DO, 수온 및 pH를 측정 분석하였다. 예비시험의 수질 검사 측정 결과를 기준으로 DO(용존산소)가 포화용준산소량의 60% 이하로 내려가지 않도록 24시간 간격으로 시험용수에 30분간 산소 공급을 하였다. TRX 형질전환콩에 대한 물벼룩 영향 평가 시험기간 중 시험용수의 DO는 0시간 처리조건에서 광안콩과 TRX 형질전환콩의 농도별 처리구에서 각각 평균 8.24 ± 0.03 (8.18 - 8.29) 및 8.19 ± 0.05 (8.14 - 8.27)이었으며, 48시간 처리 후에는 각각 평균 6.12 ± 0.11 (5.91 - 6.25) 및 6.57 ± 0.24 (6.20 - 7.02)로 측정되었다. 음성대조구(0 mg·L-1)의 0시간 처리에서는 평균 8.22과 48시간후에는 7.14로 측정되었다(Table 2). 수온은 광안콩과 TRX 형질전환콩에 대하여 각각 20.1 ± 0.1℃ (20.1 - 20.2℃) 및 20.1 ± 0.1℃ (20.1 - 20.2℃)로 일정하게 유지되었다. 환경생물 독성시험 방법과 기준(농촌진흥청 고시 제 2010-29호)에서 제시된 물벼룩 독성평가 시험 방법의 적정 수온인 18 - 22℃ 수준 내에서 시험 용수의 수온을 유지되었다(Table 3). pH는 0시간 처리조건에서 광안콩과 TRX 형질전환콩의 농도별 처리구에서 각각 평균 7.66 ± 0.08 (7.52 - 7.78) 및 7.64 ± 0.08 (7.51 - 7.81)이었으며, 48시간 처리 이후에는 각각 7.60 ± 0.09 (7.48 - 7.73) 및 7.60 ± 0.09 (7.48 - 7.74)로 측정되었다. 음성대조구(0 mg·L-1)의 0시간 처리에서는 평균 7.84과 48시간후에는 7.76로 측정되었다(Table 4). 본 실험에서 시험 용수의 DO, 온도, pH에 의한 물벼룩 급성 독성 실험의 영향 요소로는 작용하지 않음을 확인하였다.

Table 2. Changes of dissolved oxygen (DO) during cumulative immobility tests of Daphnia magna in nongenetically modified soybean (Gwangan) and Theoredoxin (TRX) transgenic soybean. http://dam.zipot.com:8080/sites/kjoas/images/N0030470408_image/Table_KJOAS_47_04_08_T2.png
Table 3. Changes of water temperature (℃) during cumulative immobility tests of Daphnia magna in nongenetically modified soybean (Gwangan) and Theoredoxin (TRX) transgenic soybean. http://dam.zipot.com:8080/sites/kjoas/images/N0030470408_image/Table_KJOAS_47_04_08_T3.png
Table 4. Changes of pH during cumulative immobility tests of Daphnia magna in non-genetically modified soybean (Gwangan) and Theoredoxin (TRX) transgenic soybean. http://dam.zipot.com:8080/sites/kjoas/images/N0030470408_image/Table_KJOAS_47_04_08_T4.png

TRX 형질전환콩과 광안콩의 처리 농도에 따른 물벼룩에 대한 유영 저해 분석

수환경의 대표적인 환경생물 독성 시험종인 물벼룩은 무기 및 유기 독성물질에 민감하게 반응하므로, 급성 독성 평가를 위해서는 일반적으로 24시간 및 48시간 후의 유영저해에 대한 평가가 수행한다. 이에 TRX 형질전환콩과 광안콩의 물벼룩 급성독성시험을 48시간 동안 지수식으로 농도당 처리된 노출 물벼룩에 대한 일반중독증상 및 생사수 관찰을 조사하였다.

광안콩 처리구에서 156 - 5,000 mg·L-1의 시험농도에서 물벼룩 급성독성시험을 실시한 결과, 24시간 경과시 156 mg·L-1 처리구에서는 유영저해 개체가 없었으나, 313, 625, 1,250, 2,500, 5,000 mg·L-1 처리구에서 24시간 경과시 각각의 농도에서 6.6, 20, 30, 50, 93.3%의 유영저해 개체가 관찰되었으며, 48시간 경과시 156 mg·L-1 처리구에서는 유영저해 개체가 없었으나, 313, 625, 1,250 mg·L-1 처리구에서는 16.6, 43.3, 56.6%의 유영저해 개체가 관찰되었다. 2,500, 5,000 mg·L-1 처리구에서는 48시간 후에 모두 100% 유영저해 개체로 관찰되었다. TRX 형질전환콩 처리구에서 156 - 5,000 mg·L-1의 시험농도에서 물벼룩 급성 독성 시험을 실시한 결과, 24시간 경과시 156 mg·L-1 처리구에서는 유영저해개체가 없었으나, 313, 625, 1,250, 2,500, 5,000 mg·L-1 처리구에서 각각의 농도에서 3.3, 13.3, 40, 66.6, 93.3%의 유영저해 개체가 관찰되었으며, 48시간 경과시 156 mg·L-1 처리구에서는 광안콩과 동일하게 유영저해 개체가 없었으나, 313, 625, 1,250 mg·L-1 처리구에서 13.3, 26.6, 80%의 유영저해가 관찰되었다. 48시간 경과시에 2,500및 5,000 mg·L-1 처리구에서는 모두 100% 유영저해를 보였다. 처리 기간 중 음성대조군(0 mg·L-1)과 TRX 형질전환콩과 광안콩의 156 mg·L-1 처리구에서는 일반중독증상 및 특이증상은 관찰되지 않았다. 그러나, TRX 형질전환콩과 광안콩의 313 mg·L-1 이상의 처리 농도 조건에서 일반중독증상인 수조 상단에서 유영하는 개체가 관찰되었다(Table 5). TRX 형질전환콩과 광안콩의 각 시험농도에서 물벼룩 유영저해 개체수의 t-test 검정결과 313, 625, 1,250, 2,500 및 5,000 mg·L-1 처리구에서 24시간후에는 각각 p값이 0.51, 0.37, 0.28, 0.13 및 1으로 TRX 형질전환콩과 광안콩간의 평균 유영 개체수의 통계적인 유의차는 없었다. 또한, TRX 형질전환콩과 광안콩의 48시간 처리후의 p값은 313, 625 및 1,250 mg·L-1 처리구에서 각각 0.51, 0.25, 0.15 이였으며, 모든 처리농도에서 TRX 형질전환콩과 광안콩간의 평균 유영 개체수에는 통계적인 유의적인 차이가 없었다(p > 0.05). 따라서 모든 처리구에서, TRX 형질전환콩과 모품종인 광안콩의 유영저해 개체수의 통계적인 유의적인 차이는 없는 것으로 분석되었다. 이와 같은 결과는 국내 개발된 비타민 A강화벼와 병저항성 GM벼의 물벼룩 급성독성 결과 및 비타민 E 강화콩의 물벼룩 급성독성 결과에서도 유사한 경향을 보였다(Oh et al., 2012; Oh et al., 2014a; Oh et al., 2016). 또한, 전반적으로 유기물인 광안콩과 TRX 형질전환콩의 처리 시간 경과와 농도의 증가함에 따라 유영저해가 비슷한 경향을 보여, TRX 형질전환콩에 처리에 의한 물벼룩의 일반 중독에 영향을 미치지 않은 것으로 사료된다.

TRX 형질전환콩과 광안콩의 급이에 의한 물벼룩에 대한 급성독성

TRX 형질전환콩과 광안콩의 물벼룩 급성 독성시험을 수행한 결과, 24시간-EC50은 광안콩은 1,811 mg·L-1, TRX 형질전환콩에서는 1,587 mg·L-1로 분석되었으며, 48시간-EC50은 광안콩은 778 mg·L-1 (95% 신뢰한계: 637.4 - 948.3 mg·L-1), TRX 형질전환콩은 755.6 mg·L-1 (95% 신뢰한계: 633.0 - 901.7 mg·L-1)로 TRX 형질전환콩이 다소 높은 급성독성을 보였으나, 95% 신뢰한계 구간 내의 차이로 유의성은 없는 것으로 나타났다(Table 6). 무영향농도는 TRX 형질전환콩과 광안콩의 두 품종에서 156 mg·L-1으로 확인되었다. 이는 TRXBar (PAT) 유전자가 도입된 TRX 형질전환콩 및 광안콩에 의한 물벼룩 영향평가 결과, 상대적 동등성을 보였으며, barTRX 유전자의 단백질 노출이 물벼룩에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

Table 5. Cumulative immobility of Daphnia magna in non-genetically modified soybean (Gwangan) and Theoredoxin (TRX) transgenic soybean. http://dam.zipot.com:8080/sites/kjoas/images/N0030470408_image/Table_KJOAS_47_04_08_T5.png
Table 6. EC50 (effective concentration 50) values of Daphnia magna after 24 and 48 hours in non-genetically modified soybean (Gwangan) and Theoredoxin (TRX) transgenic soybean. http://dam.zipot.com:8080/sites/kjoas/images/N0030470408_image/Table_KJOAS_47_04_08_T6.png

z95% confidence limits.

국외에서 수입되는 GM작물의 수입량 증가에 따른 수송로 주변의 생태 환경과 국내 개발 GM작물의 실용화에 따른 재배지 주변의 농업환경 생물종 선정 및 농업환경 생물종에 대한 영향 평가의 필요성이 증대되고 있다. 국내에서 개발된 GM작물인 병저항성 GM벼와 비타민 A 강화벼에 대한 잉어와 미꾸리의 영향평가 결과, 모품종과 통계적인 유의적 차이가 없음을 보고하였다(Oh et al., 2013; Oh et al., 2014b). 국내에서 개발된 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis)에 저항성을 가진 해충저항성 Bt 벼(Agb0101)의 물벼룩 급성 독성 평가 시에 48시간-EC50 값이 4,429.13 mg·L-1 (95% 신뢰한계는 3,908.13 - 5,020.36 mg·L-1)로 보고되었고(Oh et al., 2011), β-카로틴 생합성하는 비타민 A 강화벼의 물벼룩 급성 독성 평가에서는 48시간-EC50 값은 3,311.40 mg·L-1 (95% 신뢰한계: 2,901.39 - 3,779.23 mg·L-1)로 보고하였다(Oh et al., 2012). 비타민 E 강화콩의 영향 평가에서도 48시간-EC50은 2,416 mg·L-1 (95% 신뢰한계: 1,219.7 - 4,152.2 mg·L-1) 로 보고되었다(Oh et al., 2016). 그러나, 이와 같은 결과는 TRX 형질전환콩에 비해 48시간-EC50의 절대적인 수치가 3배이상 차이를 보였다. 이는 농약 및 중금속 등에 대한 물벼룩의 IC50과 EC50값이 상당히 광범위 형성되어 물벼룩 급성독성 실험 시 실험 방범, 조건 및 장소의 차이가 있다는 Lee et al. (2007)의 보고와 같이 시료(콩품종)의 차이와 처리 조건뿐만 아니라 실험 재료 생산된 재배지의 지역적인 환경 등의 요인에 의한 차이로 사료된다(Lee et al., 2007).

Cry1Ab 유전자가 형질전환된 해충저항성 GM옥수수(MON810)을 이용하여 물벼룩 장기 영향 평가를 수행한 결과, 해충저항성 GM옥수수가 비형질전환 옥수수에 비해 처리 5일차 내에서는 생존률의 차이는 나타나지 않았으나, 42일의 장기 영향 평가시에는 세대의 성숙기간, 산란수, 세대 전진 시기 등에 차이를 보이는 결과가 보고되어서(Thomas et al., 2010), 향후에 TRX 형질전환콩의 물벼룩에 대한 영향 평가를 42일 이상의 장기간 평가와 세대 전진에 따른 유전 독성에 대한 안전성 평가를 수행할 필요성이 있다고 사료된다.

국내 개발된 TRXbar 유전자가 도입된 화장품 소재용 TRX 형질전환콩이 수서환경 생물종인 물벼룩에 미치는 영향을 분석한 결과, 모품종인 광안콩와 통계적인 유의적인 차이가 없음을 확인하였고 TRX 단백질 노출에 의한 부정적인 영향을 미치지 않은 결과를 확인하였다. 따라서, TRX 형질전환콩과 광안콩이 콩 재배지 주변의 수로와 하천 등의 수환경에 방출되었을 때 수서환경 생물종인 물벼룩에 미치는 생물학적인 영향의 차이가 비슷할 것으로 사료된다. 향후, TRX 형질전환콩을 포함한 GM콩에 대한 환경위해성 평가 요소 중 수서환경 생물종에 대한 평가 시에 GM콩의 누대 세대의 처리에 따른 수서환경 생물종의 각 세대별에 따른 생체 기능 이상 증상, 생식 독성 분석 및 유전자 변이 평가가 수행되어야 할 것이며, 본 연구 결과는 이를 위한 기초 자료 제공과 가이드라인으로 활용될 수 있을 것이다.

Conclusion

본 연구는 인간(human) 유래 TRX 유전자를 광안콩에 형질전환시킨 화장품 소재용 TRX 형질전환콩의 환경위해성 평가에 대한 기초 자료 및 안전성 평가 가이드라인을 개발하고자 TRX 형질전환콩에 도입된 유전자의 발현 분석과 검증 및 수서 생물종인 물벼룩에 미치는 영향을 비형질전환콩인 광안콩과 비교 분석을 수행하였다. TRX 형질전환콩에 도입된 TRX 와 bar 유전자의 PCR 분석 결과, TRX 형질전환콩에서만 특이적인 밴드가 검출되었으며, TRX 단백질 발현을 ELISA 분석한 결과, TRX 형질전환콩에서만 발현되었고, 발현량은 153 ng·g-1 수준으로 분석되었다. TRX 형질전환콩과 모품종인 광안콩의 수서생물종인인 물벼룩에 대한 급성독성시험을 수행한 결과, TRX 형질전환콩의 48시간-EC50은 755.6 mg·L-1 (95% 신뢰한계는 633.0 - 901.7 mg·L-1), 무영향 농도(NOEC)는 156 mg·L-1 이였으며, 광안콩은 48시간-EC50은 778 mg·L-1 (95% 신뢰한계는 637.4 - 948.3 mg·L-1), 무영향농도는 156 mg·L-1 로 분석되었다. 처리기간 중 화장품 소재용 TRX 형질전환콩과 광안콩간의 급성독성에 영향을 미칠 수 있는 요인은 발생하지 않았으며, 통계적인 유의적인 차이를 보이지 않았다.

Acknowledgements

본 연구는 농촌진흥청 바이오그린21사업(과제번호: PJ01368603)의 지원에 의해 이루어진 것입니다.

Authors Information

Sung-Dug Oh, https://orcid.org/0000-0001-8574-6773

Seok-Ki Min, Korea Testing & Research Institute, Senior Researcher

Jae Kwang Kim, Incheon National University, Professor

Jung-Ho Park, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Senior Researcher

Chang-Gi Kim, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Senior Researcher

Soo Yin Park, National Institute of Agricultural Sciences, Researcher

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